關于生物學實驗報告三篇

　　篇一：劉希偉201100140041分子生物學實驗報告

　　質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

　　姓名：XXX學號：2011001400XX年級：20XX級生物基地班 實驗日期：2013年9月16日—30日組別：6組 同組者：XX

　　一、【實驗目的】

　　1、掌握堿變性提取法提取大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的原理和方法。

　　2、學習并掌握凝膠電泳進行DNA的分離純化的實驗原理。

　　3、學習并掌握凝膠的制備及電泳方法。

　　4、學習并掌握凝膠中DNA的分離純化方法。

　　二、【實驗原理】

　　1、質(zhì)粒DNA的制備方法

　　質(zhì)粒（Plasmid）是獨立存在于染色體外、能自主復制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細菌、放線菌、真菌以及一些動植物細胞中，但在細菌細胞中含量最多。細菌質(zhì)粒大小介于1～200Kb之間，是應用最多的質(zhì)粒類群，在細菌細胞內(nèi)它們利用宿主細胞的復制機構(gòu)合成質(zhì)粒自身的DNA。

　　質(zhì)粒DNA的制備包括3個步驟：①培養(yǎng)細菌，使質(zhì)粒DNA大量擴增；②收集和裂解細菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。主要方法包括：堿裂解法：0。2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于質(zhì)粒大量提取。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途進行選擇。本實驗選擇堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

　　2、質(zhì)粒DNA的提取——堿變性提取法

　　在細菌細胞中，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復性所依賴的溶pH值不同。在pH值高達12。0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補鏈不完全分離。因為它們在拓撲學上是相互纏繞的。當用pH值4。6的KAc（NaAc）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質(zhì)粒DNA可恢復原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)—SDS復合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀

　　DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。

　　3、凝膠電泳進行DNA分離純化

　　電泳（electrophoresis）是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的速度可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA的片段，是分子生物學的核心技術(shù)之一。

　　凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠（ethidium bromide，EB）或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實驗。

　　分子生物學中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸（5—500bp）的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的.分辨率非常高，長度上相差1bp或質(zhì)量上相差0。1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進行DNA序列分析的分子基礎。雖然它能很快地進行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物，由β—D—吡喃半乳糖與3，6—脫水—L—吡喃半乳糖組成，相對分子質(zhì)量為104—105。瓊脂糖加熱至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點為40—45℃。瓊脂糖凝膠相對于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大（50至百萬bp），小片段DNA（50—20000bp）最適合在恒定輕度和方向的電場中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA的片段，進一步純化DNA等。

　　瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶有負電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率主要取決于6個因素：樣品DNA分子的大小、DNA分子的構(gòu)象、瓊脂糖濃度、電泳所用電場、緩沖液和溫度。

　　三、【實驗材料】

　　1、實驗儀器

　　培養(yǎng)皿、接種環(huán)、三角瓶、酒精燈、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、50ml離心管、1。5ml塑料離心管（Eppendorf管）、高速離心機、漩渦振蕩器、微量移液器、不同型號槍頭、天平、制膠槽、梳子、電泳儀、吸管、量筒、微波爐、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、試劑瓶、衛(wèi)生紙和記號筆、手套等。

　　2、實驗試劑

　　LB培養(yǎng)基，抗生素Ap（氨芐青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，預冷無水乙醇，TAE電泳緩沖液（10×），上樣緩沖液（6×），瓊脂糖，溴化乙錠（EB），DNA相對分子質(zhì)量標準物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5。2的醋酸鈉。

　　四、【實驗步驟】

　　1、準備實驗

　　配制LB液體培養(yǎng)基，分裝到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固體培養(yǎng)基；準備1000ul、200ul、10ul移液槍尖各一盒，1。5ml離心管若干于500ml三角瓶中，50ml離心管2個 ，將上述物品包好連同配好的培養(yǎng)基一同滅菌。

　　2、菌體培養(yǎng)

　　在含有Ap的LB平板上挑取一環(huán)攜帶有質(zhì)粒pUC19的E。coli DH5單菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基中進行37℃振蕩過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加Ap100ul

　�。�100ug/ml），質(zhì)粒pUC19具有Ap抗性基因，使得帶有pUC19的質(zhì)粒得以生長。 過夜培養(yǎng)后菌體量大，雜質(zhì)較多，然后用移液槍吸取過夜培養(yǎng)物2ml轉(zhuǎn)接于50mlLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入Ap250ul，37℃振蕩培養(yǎng)4—6h至對數(shù)生長期后期，生長速率快，代謝旺盛，酶系活躍，雜質(zhì)少，適合提取質(zhì)粒。

　　3、質(zhì)粒提取

　　（1）稱量空的50ml離心管的重量為14。331g，然后將三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒?jié)M，液面距管口約1cm，7000rpm離心5分鐘后棄去上清液，收集菌體細胞。

　�。�2）向離心管中懸滴加入5ml冰預冷的溶液Ⅰ打散菌體洗滌，用漩渦振蕩器使之充分懸浮后用槍尖吹吸混勻，同步驟（1）離心，棄去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使上清液全部流盡干燥，然后稱重得14。437g，則菌體質(zhì)量為106mg。

　　（3）洗滌后每100mg菌體應加入冰預冷的溶液Ⅰ1ml，106mg菌體按100mg菌體處理，加入溶液Ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混勻，冰浴5min。溶液Ⅰ中的葡萄糖使

　　溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；維持滲透壓，防止細胞提前破裂，防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生長。Tris—Cl溶液提供適當?shù)膒H。

　�。�4） 按比例加入新配制的溶液Ⅱ2ml（與溶液Ⅰ對應），輕加輕搖，冰浴5min。溶液變清亮透明粘稠如蛋清狀。溶液Ⅱ中的NaOH使細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化導致細胞溶解。同時，強堿性使染色體DNA、質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)變性；SDS為下一步沉淀做鋪墊。

　　（5）按比例加入冰預冷的溶液Ⅲ1。5ml（與溶液Ⅰ、Ⅱ?qū)�應），輕加輕搖，冰浴10min。溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀。沉淀為蛋白質(zhì)SDS復合物、細胞碎片和其他大分子成分。溶液Ⅲ中的HAc中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷基因組DNA，只要是50－100 kb大小的片斷，就不能再被PDS共沉淀。同時變性的質(zhì)粒DNA復性。反應形成的高鹽環(huán)境進一步加速了沉淀。

　�。�6）12000rpm離心15min，白色沉淀聚集在離心管一側(cè)，用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到另一潔凈的離心管中。然后向上清液中加入1/10體積的3MNaAc混勻，加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。

　�。�7） 以12000rpm離心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，輕輕地覆蓋沉淀，不打散沉淀，洗滌一次。

　　（8）以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應與收集沉淀面一致。去掉上清液，將離心管上沉淀部位做好標記，將離心管倒置于吸水紙上，干燥5min。粗提取的質(zhì)粒呈淺黃色，隨著水分的減少質(zhì)粒變?yōu)闊o色。所以為了完全溶解質(zhì)粒，要在離心管上標記質(zhì)粒所在位置。

　�。�9）將DNA沉淀溶于1mlTE緩沖液中，移液槍吹吸助溶，然后將溶解液轉(zhuǎn)移到一個Eppendorf管中。TE是pH緩沖液，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)，呈弱堿性，有利于保護堿基對。同時含有EDTA是二價陽離子的螯合劑，抑制DNA酶作用。

　　4、質(zhì)粒純化

　�。�1）Eppendorf管中加入RNase A（純濃度＞50ug/ml），37℃保溫0。5—1h

　�。�2）將上述的溶液平均分配到2個1。5ml的微量離心管中，每管0。5ml，分別加入與溶液等體積的（500ul）Tris飽和苯酚溶液，振蕩混勻，7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是經(jīng)Tris飽和后的，顯黃色。苯

　　酚加入后，溶液分層，苯酚向下，下層呈淺黃色，上層溶液無色，在中間產(chǎn)生大量白色沉淀，此為變性后的蛋白質(zhì)。

　�。�3）加入等體積的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到到另一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是強的蛋白變性劑，但是苯酚留在質(zhì)粒溶液中會影響DNA的酶切，它本身易被氧化，會損傷質(zhì)粒。氯仿也是蛋白變性劑，但是比酚弱，且能溶解質(zhì)粒中的脂類，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫，有利于分層更明顯。此時溶液中已看不到明顯的白色沉淀，但仍有蛋白質(zhì)的存在。

　　（4）加入等體積的氯仿溶液，振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中，得上清液400ul。

　�。�5）向上清液中加入1/10體積的NaAc混勻，再加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。

　　（6）以12000rpm，離心15min，棄去上清液，得到DNA沉淀，為白色。

　�。�7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗滌。然后以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應與收集沉淀面一致。

　�。�8）去掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，室溫干燥。用50ulTE溶解于1管中。

　　5、質(zhì)粒檢測

　�。�1）稱取0。4g的瓊脂糖，置于一錐形瓶中，在三角瓶上標好液面位置，加入40ml的1×TAE電泳緩沖液，再加入5—10ml重蒸水，以補充在溶膠過程中損失的水分。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。冷卻至50℃左右，倒入制板槽制板。

　�。�2）待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)加入1×TAE 電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面2—3cm。取1μl加電泳載樣液和3μl質(zhì)粒樣品于小紙片上，用移液槍混勻。

　�。�3）電泳1h，觀察溴酚蘭的帶（藍色）的移動。

　　（4） 把膠槽取出，小心滑出膠塊，放進EB溶液中進行染色，完全浸泡約5min。

　�。�5）凝膠成像儀觀察。

　　五、【注意事項】

　�。�1）滴加溶液II時，要逐滴加入，且要輕加輕搖溶液使之混勻，整體動作要快，因為強堿在溶液中停留時間不能過長，否則會破壞質(zhì)粒DNA。

　　（2）加入溶液III后，生成了大量的絮狀沉淀，溶液III中和強堿使質(zhì)粒復性，不可劇烈震蕩， 防止染色體DNA斷裂，應該上下顛倒離心管，使其混勻。

　　篇二：山東大學細胞生物學實驗報告

　　一，實驗目的：

　　1，了解小鼠膜的剪取方法，以及小鼠的內(nèi)部結(jié)構(gòu)。

　　2，掌握并了解蘇丹三染色的原理及方法。

　　3，理解蘇丹Ⅲ脂類染色的基本原理。

　　二，實驗原理：

　　脂類細胞化學的主要目的是研究細胞中脂類物質(zhì)的成分變化以及分布。

　　在動物細胞中，脂肪是動物體主要的儲能物質(zhì)，很多種細胞都含有脂肪。

　　通常，細胞中的脂肪和類脂體混合物以游離的液滴狀態(tài)懸浮在細胞質(zhì)中，比

　　如肝細胞。在脂肪含量很高的`脂肪細胞中，游離的脂肪液滴可以聚集在一起，

　　占據(jù)大部分細胞質(zhì)空間，將細胞質(zhì)、細胞核擠到細胞邊緣。

　　脂類染色最常用的染料是蘇丹系列染料，本實驗即使用蘇丹Ⅲ為脂肪顯

　　色。蘇丹Ⅲ是一種橙紅色偶氮染料，由于其在脂肪中的溶解度高于在乙醇中

　　的溶解度，當用70%乙醇溶解的蘇丹Ⅲ飽和溶液浸染脂肪細胞時，蘇丹Ⅲ會

　　從70%乙醇中脫離，溶解并集中在脂肪液滴中，使脂肪細胞著色（橘黃色）。

　　以70%乙醇作為蘇丹Ⅲ的溶劑可以減少乙醇對脂肪細胞中脂肪液滴的溶解，

　　染色較大的脂肪塊。染色的主要過程不涉及化學變化。

　　三，實驗器材及材料

　　1，器材 ：鑷子兩把 顯微鏡 托盤一個 剪刀一把 滴管一支 載玻片（蓋

　　玻片）

　　2，試劑：蘇丹Ⅲ染液 蒸餾水 70%乙醇 生理鹽水 甲醛鈣溶液 四，實驗步驟：

　　1、斷頭法處死小鼠，置于解剖盤中，剪開腹腔，用鑷子提起小腸將蓋玻片緊貼于腸系膜，用剪刀連同蓋玻片和其上粘的腸系膜取下，反扣于已滴加甲醛鈣的載玻片上，固定 20min。

　　2、用吸管吸取蒸餾水滴入載玻片與蓋玻片之間沖洗掉甲醛鈣溶液。

　　3、用70%乙醇溶液代替蒸餾水重復步驟二的操作，沖洗。

　　4、滴加蘇丹Ⅲ于蓋玻片上，染色30min。

　　5、吸去載玻片上溢出的染液，擦凈載玻片表面及周邊，顯微鏡觀察。 五，實驗結(jié)果及分析：

　　脂肪細胞呈圓球形，內(nèi)充滿橘黃色之類物質(zhì)

　　由于腸系膜標本過厚，細胞染色效果起初不太明顯，脂肪細胞漸漸變?yōu)殚冱S色，可觀察到清晰的脂肪細胞，但細胞分散程度較差，單細胞形態(tài)較為少見，細胞質(zhì)較難觀察的到。隨著染色時間增長，基本可以分辨出脂肪滴與細胞質(zhì)。六，實驗總結(jié)：

　　1，制作腸系膜玻片時要注意去除血管組織，盡量將其壓薄，便于后期染色，觀察。

　　2，染色必要時可采取反扣蓋玻片染色，以保證染色充分，均勻。 3，染色完后去除多余染液以便于觀察。

　　篇三：山東大學微生物生理生化反應實驗報告

　　一、【實驗目的】

　　1。 證明不同微生物對各種有機大分子物質(zhì)的水解能力不同，從而說明不同微生物有著不同的酶系統(tǒng)。 2。掌握進行微生物大分子物質(zhì)水解試驗的原理和方法。 3。了解糖發(fā)酵的原理和在腸細菌堅定中的重要作用。 4。掌握通過糖發(fā)酵鑒別不同微生物的方法。

　　5。 了解吲哚和甲基紅試驗的原理以及其在腸道細菌鑒定中的意義和方法。

　　二、【實驗儀器與試劑】

　　菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、銅綠假單胞菌、普通變形桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌

　　培養(yǎng)基：培養(yǎng)基：固體淀粉培養(yǎng)基、固體油脂培養(yǎng)基（大分子水解試驗）；葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基、乳糖

　　發(fā)酵培養(yǎng)基（內(nèi)裝有倒置的德漢氏小管）（糖發(fā)酵試驗）；蛋白胨水培養(yǎng)基（吲哚試驗）；葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基；

　　試劑：盧戈氏碘液、乙醚、吲哚試劑、甲基紅試劑、蒸餾水、

　　儀器：酒精燈、接種針、培養(yǎng)皿、試管、試管架、燒杯、量筒、德漢氏小管

　　三、【實驗原理】

　　1。在所有生活細胞中存在的全部生物化學反應稱之為代謝，代謝過程主要是酶促反應過程，由于各種微生物具有不同的酶系統(tǒng)，所以他們能利用的底物不同，或雖利用相同的底物但產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物卻不同，因此可以利用各種生理生化反應來鑒別不同的細菌，尤其是在腸桿菌科細菌的鑒定中，生理生化試驗占有重要的地位。

　　2。淀粉的水解：由于微生物對淀粉這種大分子物質(zhì)不能直接利用，必須靠產(chǎn)生的胞外酶將大分子物質(zhì)分解才能被微生物吸收利用。胞外酶主要為水解酶，通過加水裂解大的'物質(zhì)為較小的化合物，使其能被運輸至細胞內(nèi)。如淀粉酶水解淀粉為小分子的糊精，雙糖和單糖；而淀粉遇碘液會產(chǎn)生藍色，因此能分泌胞外淀粉酶的微生物，則能利用其周圍的淀粉，在淀粉培養(yǎng)基上培養(yǎng)用碘處理其菌落周圍不呈藍色，而是無色透明圈，據(jù)此可分辨微生物能否產(chǎn)生淀粉酶。

　　3。油脂的水解：在油脂培養(yǎng)基上接種細菌，培養(yǎng)一段時間后觀察菌苔的顏色，若出現(xiàn)紅色斑點，則說明此中菌可產(chǎn)生分解油脂的酶。

　　4。 糖發(fā)酵試驗：糖發(fā)酵試驗是常用的鑒別微生物的生化反應，在腸道細菌的鑒定上尤為重要。絕大多數(shù)細菌都能利用糖類作為碳源和能源，但是它們在分解糖類物質(zhì)的能力上有很大的差異。有些細菌能分解某種糖產(chǎn)生有機酸（如乳酸，醋酸，丙酸等）和氣體（如氫氣，甲烷，二氧化碳等）;有些細菌只產(chǎn)酸不產(chǎn)氣。例如大腸桿菌能分解乳糖和葡萄糖產(chǎn)酸并產(chǎn)氣。產(chǎn)酸后再加入溴甲酚指示劑后會使溶液呈黃色，且德漢氏小管中會收集到一部分氣體。若細菌不能使糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣，則最后溶液為指示劑的紫色，且德漢氏小管中無氣體。 5。IMVC實驗主要用于快速鑒別大腸桿菌和產(chǎn)氣腸桿菌。

　�。�1）吲哚試驗：是用來檢測吲哚的產(chǎn)生，在蛋白胨培養(yǎng)基中，若細菌能產(chǎn)生色氨酸酶，則可將蛋白

　　胨中的色氨酸分解為丙酮酸和吲哚，吲哚與對二甲基苯甲醛反應生成玫瑰色的玫瑰吲哚。但并非所有的微生物都具有分解色氨酸產(chǎn)生吲哚的能力，所以吲哚實驗可以作為一個生物化學檢測

　　的指標。大腸桿菌吲哚反應陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。

　�。�2）甲基紅試驗（MR）：某些細菌在糖代謝過程中分解葡萄糖生成丙酮酸，后者進而被分解產(chǎn)生甲酸，

　　乙酸和乳酸等多種有機酸，培養(yǎng)基就會變酸，使加入培養(yǎng)基中的甲基紅指示劑由橙黃色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色，即甲基紅反應。大腸桿菌為陽性，產(chǎn)氣腸桿菌為陰性。

　　四、【實驗步驟】

　　1。 淀粉水解實驗

　　（1）倒平板：按照淀粉培養(yǎng)基配方配制固體淀粉培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，在酒精

　　燈火焰旁倒平板，每組兩個平板。 （2）用記號筆在平板底部劃成四部分。

　�。�3）接種：在無菌操作臺上，將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別在不

　　同的部分點種，如圖一所示，注意僅用接種針接觸極少面積的培養(yǎng)基，在平板的反面對應部分貼上標簽，標簽上分別寫上菌名，以免混淆。 （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28℃溫箱中培養(yǎng)兩天。

　�。�5）觀察：取出培養(yǎng)基，觀察各種細菌的生長情況，打開平板蓋子，滴入少量盧戈氏碘液于平板中，

　　輕輕旋轉(zhuǎn)平板，使碘液均勻鋪滿整個平板，觀察培養(yǎng)皿中菌落周圍是否有無色透明圈，若有無色透明圈出現(xiàn)，說明淀粉已經(jīng)被水解，為陽性，反之則為陰性。記錄實驗結(jié)果。

　　圖一：淀粉水解試驗接種示意圖圖二：油脂水解試驗接種示意圖 2。油脂水解試驗

　�。�1）倒平板：按照油脂培養(yǎng)基配方配制固體油脂培養(yǎng)基，滅菌，待培養(yǎng)基冷卻至50℃左右，充分振蕩，

　　使油脂均勻分布，在酒精燈火焰下倒平板，每組兩個平板。 （2）用記號筆在在平板底部劃成四部分。

　�。�3）接種：在無菌操作臺上將枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和銅綠假單胞菌分別劃十字線接種于平板相對應部分的中心，如圖二所示，并貼好標簽，標簽上注明菌種的名稱。 （4）培養(yǎng)：將平板倒置，在28℃溫箱中培養(yǎng)兩天。

　　（5）觀察：取出平板，觀察菌苔顏色，如果出現(xiàn)紅斑點，說明脂肪水解，為陽性反應。記錄實驗結(jié)果。 3。葡萄糖發(fā)酵實驗

　　（1）培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏

　　小管中注滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進入空氣，每組五只試管，滅菌。

　　（2）接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時，在無菌操作臺上，取葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支接入大腸桿菌，

　　再取兩只接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡，第五支不接種，作為對照。在各試管外壁上貼上標簽，標簽上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種的細菌菌名。

　　（3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實驗結(jié)果。4。乳糖發(fā)酵實驗

　�。�1）培養(yǎng)基的配制：按照糖發(fā)酵培養(yǎng)基配置乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基，分裝至試管中，用膠頭滴管往德漢氏小

　　管中注滿培養(yǎng)基，再把德漢氏小管倒置放入試管中，注意不要讓德漢氏小管中進入空氣，每組五只試管，滅菌。

　�。�2）接種：待培養(yǎng)基冷卻至常溫時，在無菌操作臺上，取乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基試管2支接入大腸桿菌，再

　　取兩只接入普通變形桿菌，接種后輕搖試管，使其均勻，防止倒置的小管進入氣泡第五支不接種，作為對照。在各試管外壁上貼上標簽，標簽上分別標明發(fā)酵培養(yǎng)基的名稱和所接種的細菌菌名。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：觀察各試管顏色變化及德漢氏小管中有無氣泡，并記錄實驗結(jié)果。 5。吲哚試驗

　�。�1）培養(yǎng)基的配制：按照蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組五只試管，在高壓蒸氣

　　鍋內(nèi)滅菌。

　�。�2）接種：待培養(yǎng)基冷卻后，在無菌操作臺上將大腸桿菌接入2支蛋白胨水培養(yǎng)基，產(chǎn)氣腸桿菌接入2

　　支蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對照，貼好標簽。

　�。�3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：往培養(yǎng)后的蛋白胨水培養(yǎng)基內(nèi)加入3~4滴乙醚，搖動數(shù)次，靜置1min，待乙醚上升后，沿試

　　管避徐徐加入2滴吲哚試劑。在乙醚和培養(yǎng)物之間產(chǎn)生紅色環(huán)狀物為陽性反應。觀察加入試劑后試管內(nèi)的顏色反應并記錄實驗結(jié)果。6。甲基紅試驗

　�。�1）培養(yǎng)基的配制：按照葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝至試管中，每組五只試管，在高

　　壓蒸氣鍋內(nèi)滅菌。

　　（2）接種：待培養(yǎng)基冷卻后，在無菌操作臺上將大腸桿菌接入2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，產(chǎn)氣腸桿菌

　　接入2支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基，剩余一只試管不接種，作為空白對照，貼好標簽。 （3）培養(yǎng)：把接種后的試管放在試管架上，把試管連同試管架放入培養(yǎng)箱中于28℃下培養(yǎng)兩天。 （4）觀察：培養(yǎng)兩天后后，將每支葡萄糖蛋白胨水培養(yǎng)基培養(yǎng)物內(nèi)加入2滴甲基紅試劑，培養(yǎng)基變?yōu)榧t

　　色者為陽性，變?yōu)辄S色者為陰性。觀察試管內(nèi)的顏色變化，并記錄實驗結(jié)果。

　　五、【實驗結(jié)果及分析】

　　實驗結(jié)果記錄

　　淀粉水解試驗：

　　油脂水解試驗：

　　葡萄糖發(fā)酵培養(yǎng)基：

　　乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基：

　　表4。 乳糖發(fā)酵試驗結(jié)果（“+”表示陽性，“—”表示陰性）

　　吲哚試驗：

　　甲基紅試驗：

　　淀粉分解實驗結(jié)果 油脂分解實驗結(jié)果

　　葡萄糖發(fā)酵實驗結(jié)果乳糖發(fā)酵實驗結(jié)果

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