微生物量：微生物大小及數(shù)量的測定

　　微生物大小及數(shù)量的測定

　　一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>

　　1.學(xué)習(xí)并掌握用測微尺測定微生物細(xì)胞大小的方法。2.了解血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造及計(jì)數(shù)原理。

　　3.掌握使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法。

　　二、實(shí)驗(yàn)原理

　　1.微生物大小測定原理

　　微生物細(xì)胞的大小是微生物的形態(tài)特征之一，也是分類鑒定的依據(jù)之一。其測量工具有目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺。鏡臺(tái)測微尺是中央部分刻標(biāo)準(zhǔn)刻尺的載玻片，其尺度總長為1mm，精確分為10個(gè)大格，每個(gè)大格又分為10個(gè)小格，共100小格，每一小格長度為0.01mm，即10μm。如圖1。

　　圖1鏡臺(tái)測微尺中央部分及鏡臺(tái)測微尺校正目鏡測微尺

　　目鏡測微尺，如圖2，是一塊可放入接目鏡內(nèi)的圓形小玻片，其中央有精確的等分刻度，一般有等分為50小格和100小格兩種。測量時(shí)，需將其放在接目鏡中的隔板上，用以測量經(jīng)顯微放大后的細(xì)胞物象。由于不同顯微鏡或不同的目鏡和物鏡組合放大倍數(shù)不同，目鏡測微尺每小格在不同條件下所代表的實(shí)際長度也不一樣。

　　圖2目鏡測微尺

　　2.血球計(jì)數(shù)板測定微生物數(shù)量的原理血細(xì)胞計(jì)數(shù)板是一塊特制的載玻片，其上由4條槽構(gòu)成3個(gè)平臺(tái)。中間較寬的平臺(tái)又被一段橫槽隔成兩半，每一邊的平臺(tái)上各刻有一個(gè)方格網(wǎng)，每個(gè)方格網(wǎng)共分9個(gè)大方格，中間的大方格即為計(jì)數(shù)室。計(jì)數(shù)室的刻度一般有兩種規(guī)格，一種是一個(gè)大方格分成25

　　個(gè)中方格，

　　而每個(gè)中方格又分成16小方格（圖5-2）；另一種是一個(gè)大方格分成16個(gè)中方格，而每個(gè)中方格又分成25個(gè)小方格，但無論是哪一種規(guī)格的計(jì)數(shù)板，每一個(gè)大方格中的小方格都是2400個(gè)。每一個(gè)大方格邊長為1mm，則每一個(gè)大方格的面積為1mm，蓋上蓋玻片后，蓋玻片

　　3與載玻片之間的高度為0.1mm，所以計(jì)數(shù)室的容積為0.1mm（10-4mL）。以25個(gè)中方格的計(jì)數(shù)板為例，設(shè)5個(gè)中方格中的總菌數(shù)為A，菌液稀釋倍數(shù)為B，則：

　　1mL菌液中的總菌數(shù)=A/5×25×10×B圖3血球計(jì)數(shù)板側(cè)面及兩種類型的計(jì)數(shù)室

　　三、實(shí)驗(yàn)

　　1.菌種枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)斜面培養(yǎng)物；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)液體培養(yǎng)基培養(yǎng)物。

　　2.溶劑和試劑

　　合成培養(yǎng)基（酵母菌液），稀釋的美藍(lán)染液（0.01%），95%酒精，二甲苯溶液，香柏油，無菌水

　　3.儀器和其他用品

　　血球計(jì)數(shù)板，顯微鏡，載玻片，酒精燈，接種環(huán)，蓋玻片，擦鏡紙，鏡臺(tái)測微尺，目鏡測微尺，無菌毛細(xì)滴管，雙層瓶，計(jì)數(shù)器

　　四、實(shí)驗(yàn)步驟

　　1、微生物大小的測定（1）裝目鏡測微尺

　　取出接目鏡，把目鏡上的透鏡片旋下，將目鏡測微尺刻度朝下放在目鏡鏡筒內(nèi)的隔板上，然后旋上目鏡透鏡，再將目鏡插入鏡筒內(nèi)。（2）校正目鏡測微尺

　�、俜喷R臺(tái)測微尺

　　將鏡臺(tái)測微尺刻度面朝上放在顯微鏡載物臺(tái)上。②校正

　　先用低倍鏡觀察，將鏡面測微尺有刻度的部分移至視野中央，調(diào)節(jié)焦距，當(dāng)清晰的看到鏡臺(tái)測微尺的刻度后，轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡使目鏡測微尺的刻度與鏡臺(tái)測微尺的刻度平行。利用移動(dòng)器移動(dòng)鏡臺(tái)測微尺，使兩尺在某一區(qū)域內(nèi)兩線完全重合，然后分別數(shù)出兩重合線之間鏡臺(tái)微尺和目鏡微尺所占的格數(shù)

　�、塾�(jì)算

　　由于已知鏡臺(tái)測微尺每格長10μm，根據(jù)下列公式即可分別計(jì)算處在不同放大倍數(shù)下，目鏡測微尺每個(gè)所代表的長度。

　　目鏡測微尺每個(gè)長度（μm）=

　　用同樣的方法換成高背景和油鏡進(jìn)行校正，分別測出在高倍鏡和油鏡下，兩重合線之間兩尺分別所占的格數(shù)。(注意：觀察時(shí)光線不宜過強(qiáng)，否則難以找到鏡臺(tái)微尺的刻度；換高倍鏡和油鏡校正時(shí)，務(wù)必十分細(xì)心，防止接物鏡壓壞鏡臺(tái)微尺和損壞鏡頭。)（3）對枯草芽孢桿菌用簡單染色法制片（4）菌體大小的測定

　　①枯草芽孢桿菌大小的測定

　　目鏡測微尺校正完畢后，取下鏡臺(tái)測微尺，換上細(xì)菌染色制片。先用低倍鏡和高倍鏡找到標(biāo)本后，換油鏡測枯草芽孢桿菌的寬度和長度。測定時(shí)，通過轉(zhuǎn)動(dòng)目鏡微尺和移動(dòng)載玻片，測出細(xì)菌直徑或?qū)捄烷L所占目鏡測微尺的格數(shù)。最后將所測得的格數(shù)乘以目鏡測微尺（用油鏡時(shí)）每格所代表的長度，即為該菌的實(shí)際大小

　�、诮湍妇�大小的測定測定酵母菌時(shí)，先將酵母菌培養(yǎng)物制成水浸片，然后用高倍鏡或油鏡測出寬和長各占目鏡微尺的格數(shù)，最后，將測得的格數(shù)乘上目鏡微尺（用高倍鏡或油鏡時(shí)）每格所代表的長度，即為酵母菌的實(shí)際大�。ㄗ⒁猓嚎蛇x擇有代表性的3~5個(gè)細(xì)胞進(jìn)行測定；細(xì)菌的大小需用油鏡測定，以減少誤差）

　　（5）測定完畢，取出目鏡測微尺后將接目鏡放回鏡筒，再將目鏡測微尺和鏡臺(tái)測微尺分別用擦鏡紙擦拭干凈，放回盒內(nèi)保存。2、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（1）鏡檢計(jì)數(shù)室

　　在加樣前，先對計(jì)數(shù)板的計(jì)數(shù)室進(jìn)行鏡檢。若有污物，則需清洗，吹干后才能進(jìn)行計(jì)數(shù)。（2）加樣品

　　將清潔干燥的血細(xì)胞計(jì)數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細(xì)滴管將搖勻的釀酒酵母菌懸液由蓋玻片邊緣滴一小滴，讓菌液沿縫隙靠毛細(xì)滲透作用自動(dòng)進(jìn)入計(jì)數(shù)室，一般計(jì)數(shù)室均能充滿菌液（注意：要搖勻菌液；加樣時(shí)計(jì)數(shù)室不可有氣泡產(chǎn)生）（3）顯微鏡計(jì)數(shù)

　　5min，然后將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板置于顯微鏡載物臺(tái)上，先用低倍鏡找到計(jì)數(shù)室所在位置，然后換成高倍鏡進(jìn)行計(jì)數(shù)。調(diào)節(jié)顯微鏡光線的強(qiáng)弱適當(dāng)，對于用反光鏡采光的顯微鏡還要注意光線不要偏向一邊，否則視野中不易看清楚計(jì)數(shù)室方格線，或只見豎線或只見橫線。（4）清洗血細(xì)胞計(jì)數(shù)板

　　完畢后，將血細(xì)胞計(jì)數(shù)板在水龍頭用水沖洗干凈，切勿用硬物洗刷，洗完后自行晾干，鏡檢，觀察每小格內(nèi)是否有殘留菌體或其他沉淀物。若不干凈，則必須重復(fù)洗滌至干凈為止。

　　五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

　　1．菌體大小的測量

　　(1)目鏡測微尺校正結(jié)果

　　(2)枯草芽孢桿菌測量結(jié)果（油鏡觀察，所得數(shù)據(jù)為所占格數(shù)）

　　(3)釀酒酵母測量結(jié)果（油鏡觀察，所得數(shù)據(jù)為所占格數(shù)）

　　(4)測量結(jié)果換算

　　2、顯微鏡直接計(jì)數(shù)法（血球計(jì)數(shù)板）結(jié)果

　　六、思考題

　　1．為什么更換不同放大倍數(shù)的目鏡或物鏡時(shí)，必須用鏡臺(tái)微尺重新對目鏡測微尺進(jìn)行校正？答：因?yàn)槟跨R測微尺每格代表的長度與物鏡倍數(shù)不是成比例的增加

　　2．在不改變目鏡和物鏡測微尺，而改用不同放大倍數(shù)的物鏡來測定同一株細(xì)菌的大小時(shí)，其測定結(jié)果是否相同？為什么？

　　答：相同。因?yàn)楦淖兾镧R放大倍數(shù)后，只要經(jīng)校正計(jì)算出正確的目鏡測微尺每格代表的長度，再進(jìn)行測量，經(jīng)計(jì)算都會(huì)得到菌的實(shí)際大小。

　　3．根據(jù)你的體會(huì)，說明用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)的誤差主要來自哪些方面?應(yīng)如何盡量減少誤差．力求準(zhǔn)確?

　　答：①樣品的濃度要適中，太濃則不易計(jì)數(shù)，太稀也會(huì)導(dǎo)致計(jì)數(shù)不準(zhǔn)確。另外稀釋時(shí)要精確。

　　②樣品稀釋后要搖勻，否則計(jì)數(shù)板每個(gè)格內(nèi)的細(xì)菌數(shù)菌量分布不均，會(huì)造成較大誤差。

　　4．某單位要求知道一種干酵母粉中的活菌存活率，請?jiān)O(shè)計(jì)1～2種可行的檢測方法。

　　答：將干酵母粉制成酵母菌液，取少量菌液于試管內(nèi)并加入少量美藍(lán)染液進(jìn)行混合，然后在血球計(jì)數(shù)板進(jìn)行觀察計(jì)數(shù)，算出所有死活菌的總數(shù)量，然后觀察計(jì)數(shù)變藍(lán)的死的菌量，兩者比就是干酵母粉中的活菌存活率。

　　七、實(shí)驗(yàn)小結(jié)

　　本實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是：

　　1.使用鏡臺(tái)測微尺進(jìn)行校正時(shí)，若一時(shí)無法直接找到測微尺，可先對刻尺外的圓圈線進(jìn)行準(zhǔn)校后再通過移動(dòng)標(biāo)本推進(jìn)器進(jìn)行尋找。

　　2.細(xì)菌在不同的生長時(shí)期細(xì)胞大小有時(shí)會(huì)有較大變化，注意選擇處于對數(shù)生長時(shí)期的細(xì)胞材料。

　　3.實(shí)驗(yàn)中進(jìn)行顯微計(jì)數(shù)時(shí)應(yīng)先在低倍鏡下尋找大方格的位置，找到計(jì)數(shù)室后將其移至視野中央，再換高倍鏡觀察和計(jì)數(shù)。

　　通過此次實(shí)驗(yàn)，我們了解了血細(xì)胞計(jì)數(shù)板的構(gòu)造及計(jì)數(shù)原理，掌握了用測微尺測定微生物細(xì)胞大小和使用血細(xì)胞計(jì)數(shù)板進(jìn)行微生物計(jì)數(shù)的方法，鞏固了微生物實(shí)驗(yàn)技能。