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微生物驗(yàn)證
什么是微生物呢？所謂微生物是指?jìng)�(gè)體微小，必須借助于顯微鏡才能看清它們外形的一群低等的、原始的微小生物，如細(xì)菌。以下是小編為大家整理的微生物驗(yàn)證，僅供參考，希望能夠幫助大家。
微生物驗(yàn)證
1.適用范圍
本方案適用于本公司各品種微生物限度檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證。
2.目的
通過(guò)驗(yàn)證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測(cè)定。
3.職責(zé)
項(xiàng)目責(zé)任人：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的起草及具體實(shí)施。
驗(yàn)證管理員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。
QA現(xiàn)場(chǎng)監(jiān)控員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證實(shí)施過(guò)程中的監(jiān)督檢查，取樣，確保結(jié)果的可靠性。
QC負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案中檢驗(yàn)方法的審核及按照規(guī)定的取樣計(jì)劃對(duì)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)操作程序的準(zhǔn)確執(zhí)
行，負(fù)責(zé)組織實(shí)施。
QC檢驗(yàn)員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案的起草與參與實(shí)施，并對(duì)所測(cè)數(shù)據(jù)準(zhǔn)確性負(fù)責(zé)。
質(zhì)量部經(jīng)理：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案及報(bào)告的審核和批準(zhǔn)。
4.內(nèi)容
4.1.概述
通過(guò)驗(yàn)證以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測(cè)定；確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的控制菌的檢查。根據(jù)樣品特性制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，按制定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。若符合，按驗(yàn)證的方法和條件進(jìn)行藥品的微生物限度檢查；若不符合，重新建立制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，再進(jìn)行驗(yàn)證，直至驗(yàn)證結(jié)果符合設(shè)立的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。
4.2細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證
當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測(cè)定。.驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。
4.2.1.驗(yàn)證用菌株及菌種要求
大腸埃希菌【CMCC（B）44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。
大腸埃希菌為革蘭氏陰性菌，金黃色葡萄球菌為革蘭氏陽(yáng)性菌，枯草芽孢桿菌為產(chǎn)芽孢桿菌，前述菌株作為細(xì)菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株；黑曲霉為霉菌，白色念珠菌為酵母菌，作為霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)驗(yàn)證用菌株。
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。
4.2.2.驗(yàn)證菌菌液制備
4.2.2.1.大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌菌液制備：接種大腸埃希菌、金色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~10-7，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。
4.2.2.2.白色念珠菌菌液制備：接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48小時(shí)；取此培養(yǎng)液1ml加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-6~
10-7，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。
4.2.2.3.接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無(wú)菌試管內(nèi)，取1ml加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-4~10-6，制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。
4.2.3.供試液的制備
4.2.3.1.無(wú)抑菌活性的供試品供試液的制備
◆稀釋劑：pH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液
◆液體供試品：供試品10ml置錐形瓶中，加入90ml稀釋劑，混勻，作為供試液（1：10）。
◆固體、半固體、粘稠性供試品供試品：稱取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。
4.2.3.2.具有抑菌活性的供試品供試液的制備當(dāng)供試品具有抑菌活性時(shí)，須先消除抑菌活性，其方法如下：
◆培養(yǎng)基稀釋法：取供試液2ml，每0.2ml的供試液注一皿或每0.1ml的供試液注一皿；或取供試液1ml每0.5ml的供試液注一皿，傾注15ml的培養(yǎng)基，測(cè)定細(xì)菌、霉菌及酵母菌的菌數(shù)，混勻，凝固，培養(yǎng)。每1ml供試液所注的平皿生長(zhǎng)的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。計(jì)算每1ml供試液的平均菌落數(shù)，按平皿法計(jì)數(shù)規(guī)則報(bào)告菌數(shù)；控制菌檢查時(shí)可加大增菌液的用量。
◆離心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量。
◆薄膜過(guò)濾法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌落數(shù)。
◆中和法：選取適宜的中和劑如磺胺類藥物加入適當(dāng)?shù)膶?duì)氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉-半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（0.1%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測(cè)定。
4.2.4.菌液組測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。采用平皿法，取試驗(yàn)用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。
4.2.5.試驗(yàn)組
4.2.5.1.平皿法：取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1ml供試液和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。
4.2.5.2.培養(yǎng)基稀釋法（平皿法）：取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1ml供試液分別注入N個(gè)平皿中，每個(gè)平皿再注入50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。
4.2.5.3薄膜過(guò)濾法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌落數(shù)。至少要一張膜。
4.2.5.4.離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗滌管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)。
4.2.6.供試品對(duì)照組
取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗(yàn)組相同）。
4.2.7.稀釋劑對(duì)照組
若供試液需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾法等處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組，用稀釋劑代替供試品，加入試驗(yàn)菌，使最終濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和計(jì)數(shù)方法計(jì)數(shù)。
4.2.8.回收率計(jì)算
4.2.8.1.試驗(yàn)組回收率計(jì)算
試驗(yàn)組的菌回收率＝試驗(yàn)組的菌回收率—供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)×100%
菌液組的平均菌落數(shù)
4.2.8.2.稀釋劑對(duì)照組回收率計(jì)算
試驗(yàn)組的菌回收率＝稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)×100%
菌液組的平均菌落數(shù)
計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。
4.2.8.結(jié)果判斷
在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。若試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。照該供試液制備方法和計(jì)數(shù)法測(cè)定供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌數(shù)；若任一次試驗(yàn)中試驗(yàn)組的菌回收率低于70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證，使試驗(yàn)組菌回收率大于70%。
4.3.控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證
當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測(cè)定。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢驗(yàn)方法應(yīng)進(jìn)行重新驗(yàn)證。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。
4.3.1.驗(yàn)證用菌株
大腸埃希菌（Esherichiacoli）【CMCC(B)44102】、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus）【CMCC(B)003】、乙型付傷寒沙門(mén)菌（SalmonellaparatyphiB）【CMCC(B)50094】、銅綠假單胞菌（Pseudomonasaeruginosa）【CMCC(B)10104】
驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代（從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。
4.3.2.菌液制備
大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)；分別取培養(yǎng)液1ml加0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至10-5~10-7，制成每1ml含菌數(shù)10～100cfu的菌懸液。
4.3.3.陰性菌對(duì)照組設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專屬性。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門(mén)菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌；驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。陰性對(duì)照菌不得檢出。
4.3.4.試驗(yàn)組
4.3.4.1.常規(guī)法
◆大腸埃希菌取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽(yáng)性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。
◆大腸菌群取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳糖發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml、0.1g或0.1ml、含供試品0.001g或0.001ml的供試液，陽(yáng)性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，按《微生物限度檢查SOP》大腸菌群項(xiàng)下規(guī)定檢查。
◆沙門(mén)菌取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽(yáng)性菌對(duì)照加入沙門(mén)菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。按《微生物限度檢查SOP》沙門(mén)菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。
◆銅綠假單胞菌取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽(yáng)性菌對(duì)照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。按《微生物限度檢查SOP》沙門(mén)菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。
◆金黃色葡萄球菌取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽(yáng)性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。
按《微生物限度檢查SOP》金黃色葡萄球菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。
4.3.4.2.培養(yǎng)基稀釋法供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強(qiáng)的樣品。
4.3.4.3.薄膜過(guò)濾法采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，過(guò)濾后，注入培養(yǎng)基或取出濾膜接入增菌培養(yǎng)基中。
4.3.4.4.離心沉淀集菌法取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。
4.3.4.5.中和法在供試品溶液中加入相應(yīng)的中和劑，以減除供試品中抑菌成分的作用，中和劑應(yīng)對(duì)微生物無(wú)毒性，與抑菌成分結(jié)合后的產(chǎn)物應(yīng)對(duì)微生物亦無(wú)毒性，或有毒性但不影響待檢菌的檢出。
4.3.5.結(jié)果判斷
至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)。陰性菌對(duì)照組不得檢出陰性對(duì)照菌。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行該供試品控制菌的檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。
5.驗(yàn)證的實(shí)施
5.1細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證記錄及控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證記錄(見(jiàn)附件)。
5.2.分析數(shù)據(jù)，綜合整個(gè)驗(yàn)證過(guò)程，得出驗(yàn)證結(jié)論。
5.3.驗(yàn)證過(guò)程中發(fā)生的異常情況，按照《偏差處理程序》進(jìn)行處理。
6.相關(guān)文件
《微生物限度檢查SOP》
微生物驗(yàn)證
xxxx軟膏微生物限度檢查方法學(xué)驗(yàn)證方案
1.驗(yàn)證目的xxxx軟膏配方中含水楊酸、硼酸，該兩種物質(zhì)具有一定的抑菌性。根據(jù)《中國(guó)藥典》（2005年版）微生物限度檢查標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定，對(duì)xxxx軟膏進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌檢查方法的驗(yàn)證試驗(yàn)，以確認(rèn)供試品的抑菌活性及測(cè)定方法的可靠性。
2.驗(yàn)證范圍本公司xxxx軟膏的微生物限度檢測(cè)。
3.判定標(biāo)準(zhǔn)
3.1驗(yàn)證小組成員
3.2細(xì)菌、霉菌及酵母菌在3次平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）應(yīng)均不低于70%，試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)的值占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）均不低于70%；產(chǎn)品的試驗(yàn)組與陽(yáng)性菌組的菌落數(shù)差異不超過(guò)30%，假定產(chǎn)品試驗(yàn)組的平均值與陽(yáng)性菌組的平均值之比為Q，則0.7≤Q≤1.3。
3.3金黃色葡萄球菌在3次平行試驗(yàn)中，供試品組：結(jié)果應(yīng)為陰性，未檢出金黃色葡萄球菌；試驗(yàn)組：結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，檢出金黃色葡萄球菌；陰性對(duì)照組：結(jié)果應(yīng)為陰性，未檢出陰性對(duì)照菌；陽(yáng)性對(duì)照組：結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，檢出金黃色葡萄球菌。
3.4銅綠假單胞菌在3次平行試驗(yàn)中，供試品組：結(jié)果應(yīng)為陰性，未檢出銅綠假單胞菌；試驗(yàn)組：結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，檢出銅綠假單胞菌；陰性對(duì)照組：結(jié)果應(yīng)為陰性，未檢出陰性對(duì)照菌；陽(yáng)性對(duì)照組：結(jié)果應(yīng)為陽(yáng)性，檢出銅綠假單胞菌。
4.驗(yàn)證方法
4.1.試驗(yàn)原料、稀釋劑和標(biāo)準(zhǔn)微生物
4.1.1試驗(yàn)樣品：xxxx軟膏三批，批號(hào)為、、。
4.1.2稀釋劑：PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液。配法：照（05版藥典附錄xIIIC）配制；0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液的配制：取氯化鈉9.0g，加1000ml使完全溶解，分裝，滅菌。4.1.3實(shí)驗(yàn)儀器：無(wú)菌培養(yǎng)皿（直徑9.0cm）、凈化室、滅菌鍋、無(wú)菌刻度吸管（10ml、1ml）,水浴鍋，試管（18×180）,具塞三角瓶。
4.1.4驗(yàn)證用培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基、膽鹽乳糖培養(yǎng)基、溴化十六烷基三甲銨培養(yǎng)基、玫瑰紅鈉培養(yǎng)基。
4.1.5驗(yàn)證用微生物名稱及編號(hào)
4.1.6菌液制備接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中培養(yǎng)18～24小時(shí)；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂培養(yǎng)基中，培養(yǎng)24～48小時(shí)；上述培養(yǎng)物用0.9%無(wú)菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數(shù)為50～100cfu的菌懸液。4.1.7供試品溶液的制備稱取xxxx軟膏10g，置滅菌三角瓶中，加入PH7.0無(wú)菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液至100ml，45℃下使之全部溶化，搖勻，作為1：10的供試品溶液。4.2細(xì)菌、霉菌及酵母菌驗(yàn)證內(nèi)容
4.2.1試驗(yàn)組：分別取1:10供試品
溶液0.2ml注入兩個(gè)平皿，接種50-100個(gè)挑戰(zhàn)微生物，每株試驗(yàn)菌平兩行制備兩個(gè)平皿（分別注入以上四種菌懸液），向平皿內(nèi)倒冷卻至45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌）或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（白色念珠菌霉）15～20ml：并混合均勻凝固后，置于所需溫度下培養(yǎng)。
4.2.2菌液組：不加供試液，直接將試驗(yàn)菌株接種于2個(gè)平皿中，其余操作步驟同樣品試驗(yàn)組操作。
4.2.3供試品對(duì)照組：取1:10供試品溶液0.2ml分別注入兩個(gè)平皿，向平皿內(nèi)倒冷卻到45℃的營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（細(xì)菌）或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（白色念珠菌霉）15～20ml,并混合均勻凝固后，置于所需溫度下培養(yǎng)。
4.2.4上述操作，應(yīng)做三次平行試驗(yàn)，分別計(jì)算各次試驗(yàn)的菌的回收率。
試驗(yàn)組的菌回收率=[(試驗(yàn)組平均菌落數(shù)－供試品對(duì)照組平均菌落數(shù))/菌液組平均菌落數(shù)]×100%。
4.2.5培養(yǎng)：營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平皿倒置于30-35℃下培養(yǎng)48h，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基或酵母浸出
微生物驗(yàn)證
1、微生物的定義
什么是微生物呢？所謂微生物是指?jìng)�(gè)體微小，必須借助于顯微鏡才能看清它們外形的一群低等的、原始的微小生物，如細(xì)菌。（體型微小，必須借助于光學(xué)顯微鏡或電子顯微鏡才能看到它們的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，有的具有細(xì)胞構(gòu)造，有的甚至沒(méi)有細(xì)胞構(gòu)造，生長(zhǎng)繁殖快，對(duì)物質(zhì)具有非常強(qiáng)烈的轉(zhuǎn)化作用；容易引起變異，以致微生物的種類特別繁多，并且新的種類還在不斷產(chǎn)生；數(shù)量多，分布廣，對(duì)自然環(huán)境的適應(yīng)性強(qiáng)，以致在自然界的任何地方如土壤、空氣、水以及人和動(dòng)植物體上都有微生物生活或生存）
2、微生物的特點(diǎn)
微生物是結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、繁殖快、分布廣、個(gè)體最小的生物。
2.1結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單：微生物多數(shù)是單細(xì)胞；
2.2生長(zhǎng)旺，繁殖快（大腸桿菌在它的適宜37-44℃之間，20-30分鐘繁殖一代）
2.3分布廣.種類多（10萬(wàn)多種）：自然界中到處都有，如水、空氣、土壤等。
2.4個(gè)體�。盒∮�0.1mm。在形態(tài)上，個(gè)體微小，肉眼看不見(jiàn)，需用顯微鏡觀察，細(xì)胞大小以微米和納米計(jì)量。
2.5適應(yīng)性強(qiáng)，易變異。相對(duì)于高等生物而言，較容易發(fā)生變異。在所有生物類群中，已知微生物種類的數(shù)量?jī)H次于被子植物和昆蟲(chóng)。微生物種內(nèi)的遺傳多樣性非常豐富。
2.6代謝活性強(qiáng)，轉(zhuǎn)化快。
3、微生物的分類
葡萄球菌
酵母菌芽痕
棒狀桿菌大腸桿菌
大腸桿菌放線桿菌
分裂的大腸桿菌黑曲霉
黑曲霉弧狀菌
腳氣真菌酵母菌
蠟狀芽孢桿菌鏈球菌
面包酵母啤酒酵母
球菌沙門(mén)氏菌
食品中微生物的污染源
水、空氣、土壤、人和動(dòng)植物
4、微生物在自然界的分布
自然界中微生物的分布極為廣泛，水中、高山、海底、荒漠、極地、空氣等到處都生存著各種各樣、形形色色的微生物。
土壤中的微生物
土壤中的微生物：
土壤是微生物的天然培養(yǎng)基，它具備微生物正常發(fā)育所必須的一切條件：土壤中含有一定的無(wú)機(jī)物和有機(jī)物；
土壤中含有適當(dāng)?shù)乃�；大多�?shù)中性偏堿,適合大多數(shù)微生物生長(zhǎng)；
土壤中還含有氣體，主要是CO2、O2和N2；
溫度變化不大（10-25℃）。
土壤中的微生物
土壤中含有大量的微生物，土壤中的細(xì)菌來(lái)自天然生活在土壤中的自養(yǎng)菌和腐物寄生菌以及隨動(dòng)物排泄物及其尸體進(jìn)入土壤的細(xì)菌。
土壤中微生物的分布：表層受日光照射和干燥的影響，不利于其生存，所以細(xì)菌數(shù)量少，離地面10-20厘米土層微生物最多.土層越深，菌數(shù)越少。
水中的微生物
水也是微生物存在的天然環(huán)境，水中的細(xì)菌來(lái)自土壤、塵埃、污水、人畜排泄物及垃圾等。水中微生物種類及數(shù)量因水源不同而異。
受到污染的水中含有大量的有機(jī)物，適合微生物的生存。靜水中的微生物多，流水中的少；離岸近處微生物多，離岸遠(yuǎn)處少；經(jīng)過(guò)大城市的河流，水受到污染，含有大量的糞便.并含有大量的致病菌。
水中的微生物
井水和泉水中細(xì)菌少，雨水、雪水中也少，城市上空的雨水細(xì)菌多，鄉(xiāng)村上空雨水細(xì)菌少。
國(guó)家規(guī)定，自來(lái)水中，細(xì)菌總數(shù)每毫升不得超過(guò)100個(gè)，大腸菌群不得超過(guò)3個(gè)/升
空氣中的微生物
空氣中由于缺乏營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、干燥及日光的照射，大部分的微生物被殺死，所以，空氣中沒(méi)有微生物生長(zhǎng)發(fā)育的條件。但由于空氣的流動(dòng)，風(fēng)的作用，使地面的微生物飛揚(yáng)到空中，因而，接近地面的空氣層，就含有一定的微生物。
雖然空氣中的微生物數(shù)量較少，但危害大。因?yàn)榭諝饬鲃?dòng)快，流動(dòng)的范圍廣，影響面大。
空氣中的微生物
在冬春季節(jié)，更容易發(fā)生感冒等傳染病，就是因?yàn)榭諝獾膫鞑ィ貏e是在公共場(chǎng)所，人多，空氣流通差，細(xì)菌多；
大城市上空微生物數(shù)量最多，鄉(xiāng)村少；森林、草地和田野上空空氣清潔，海洋、高山、冰雪覆蓋的地面上空，微生物更為稀少。雨后空氣特別新鮮。
人體中的微生物
人自出生后，外界的微生物就逐漸進(jìn)入人體。在正常人體皮膚、粘膜及外界相通的各種控道（如口腔、鼻咽腔、腸道和泌尿道）等部位，存在著對(duì)人體無(wú)害的微生物群，包括細(xì)菌、真菌、螺旋體、支原體等。
人體中的微生物
部位常見(jiàn)菌種
皮膚表皮葡萄球菌、類白喉?xiàng)U菌、綠膿桿菌、恥垢桿菌等
口腔鏈球菌（甲型或乙型）、乳酸桿菌、螺旋體、梭形桿菌、
白色念球菌、（真菌）表皮葡萄球菌、肺炎球菌、奈瑟氏球菌、類白喉?xiàng)U菌等
胃正常一般無(wú)菌
腸道類桿菌、雙歧桿菌、大腸桿菌、厭氧性鏈球菌、糞鏈球菌
葡萄球菌、白色念球菌、乳酸桿菌、變形桿菌、破傷風(fēng)桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌等
鼻咽腔甲型鏈球菌、奈氏球菌、肺炎球菌、流感桿菌、
乙型鏈球菌、葡萄球菌、綠膿桿菌、大腸桿菌、變形桿菌等眼結(jié)膜皮表葡萄球菌、結(jié)膜干燥桿菌、類白喉?xiàng)U菌等
微生物是一些肉眼看不見(jiàn)的微小生物的總稱。但有些微生物是肉眼可以看見(jiàn)的，像屬于真菌的蘑菇、靈芝等。
大多數(shù)微生物是單細(xì)胞生物，如細(xì)菌、放線菌、支原體、立克次氏體、衣原體、藍(lán)藻以及酵母菌、單細(xì)胞藻類等；少數(shù)微生物是多細(xì)胞生物，如各種霉菌和大型真菌等。此外，還有一些沒(méi)有細(xì)胞結(jié)構(gòu)的微生物，如病毒，類病毒和朊病毒等。
微生物不僅種類繁多，其在生物圈中分布也是十分廣泛的。上至10000米的高空，深至11000米的海底，都有微生物的存在。土壤里有微生物生活需要的各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，是微生物的主要活動(dòng)場(chǎng)所。動(dòng)物體表和體內(nèi)的各種條件適宜微生物生活，也是微生物活動(dòng)的重要場(chǎng)所。此外，科學(xué)家們?cè)跔I(yíng)養(yǎng)貧乏的巖石、礦山、荒漠都發(fā)現(xiàn)了微生物的蹤跡。
從以上對(duì)微生物的介紹，我們對(duì)微生物有了一定的了解，對(duì)于廣泛存在于我們生活環(huán)境，甚至我們食用的食品也被他們?nèi)肭郑覀冇譄o(wú)法用肉眼看見(jiàn)的他們，我們?cè)撊绾螌?duì)待我們?nèi)粘Ｊ秤檬称分械奈⑸锬�，他們�?duì)于我們來(lái)說(shuō)過(guò)是敵還是友呢？
首先，我們先應(yīng)該探究這些和我們形影不離的微生物會(huì)給我們帶來(lái)怎么樣的傷害。
眾所周知，微生物是導(dǎo)致傳染病流行的最重要的病源之一。在人類疾病中有50%是由病毒引起。如鼠疫,艾滋病,癌癥,肺結(jié)核、瘧疾、霍亂,伊波拉病毒、瘋牛病、SARS、禽流感等都是由一些極少部分的微生物所致。世界衛(wèi)生組織公布資料顯示：傳染病的發(fā)病率和病死率在所有疾病中占據(jù)第一位。如1347年的一場(chǎng)由鼠疫桿菌引起的瘟疫幾乎摧毀了整個(gè)歐洲，有1/3的人(約2500萬(wàn)人)死于這場(chǎng)災(zāi)難，在此后的80年間，這種疾病一再肆虐，實(shí)際上消滅了大約75%的歐洲人口，一些歷史學(xué)家認(rèn)為這場(chǎng)災(zāi)難甚至改變了歐洲文化。我國(guó)在解放前也曾多次流行鼠疫，死亡率極高。而且還證實(shí)，這些病毒還在變異，這就更加增加了對(duì)這些疾病研究的困難。全世界雖然已經(jīng)花費(fèi)了無(wú)法統(tǒng)計(jì)的經(jīng)費(fèi)，但有些疾病的危害力并沒(méi)有減小，甚至艾滋病的患者和感染者還在每年成倍增長(zhǎng)。人類和病原微生物的斗爭(zhēng)也許是一場(chǎng)永遠(yuǎn)看不到盡頭的戰(zhàn)爭(zhēng)。在疾病的預(yù)防和治療方面，人類取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，但是新現(xiàn)和再現(xiàn)的微生物感染還是不斷發(fā)生，像大量的病毒性疾病一直缺乏有效的治療藥物。一些疾病的致病機(jī)制并不清楚。大量的廣譜抗生素的濫用造成了強(qiáng)大的選擇壓力，使許多菌株發(fā)生變異，導(dǎo)致耐藥性的產(chǎn)生，人類健康受到新的威脅。一些分節(jié)段的病毒之間可以通過(guò)重組或重配發(fā)生變異，最典型的例子就是流行性感冒病毒。每次流感大流行流感病毒都與前次導(dǎo)致感染的株型發(fā)生了變異，這種快速的變異給疫苗的設(shè)計(jì)和治療造成了很大的障礙。而耐藥性結(jié)核桿菌的出現(xiàn)使原本已近控制住的結(jié)核感染又在世界范圍內(nèi)猖獗起來(lái)。
另外，大部分的微生物具有腐化性，即引起食品氣味和組織結(jié)構(gòu)發(fā)生不良變化。這也是我們生活中常見(jiàn)的現(xiàn)象。在這些糧食微生物中，數(shù)量最大、對(duì)糧食危害最為嚴(yán)重的是霉菌及其代謝物。他們?cè)诃h(huán)境適宜的條件下，可以分解糧食中的有機(jī)物，使之變質(zhì)、霉腐，使糧食出現(xiàn)變質(zhì)、變味、發(fā)熱、生霉等癥狀，不但嚴(yán)重糧食安全儲(chǔ)存，導(dǎo)致儲(chǔ)糧質(zhì)量劣變，而且還可能產(chǎn)生毒素污染，危急人畜安全。如歐洲的麥角中毒事件曾造成幾千人死亡；1960年在英國(guó)東南部由于黃曲霉污染引起十萬(wàn)只火雞死亡；最近中國(guó)蒙牛牛奶被檢出含強(qiáng)致癌物黃曲霉毒素M1的原因也是因?yàn)槟膛ｏ暳弦蛱鞖獬睗癜l(fā)生霉變,奶牛在食用這些飼料后,原奶中的黃曲霉毒素超標(biāo)。
微生物不僅對(duì)人畜有重大的影響，對(duì)環(huán)境也是如此。以微生物對(duì)水造成的污染為例。微生物侵入水中的方式多種多樣，有的是天然存在的，有的是由土壤進(jìn)入水中，有的是隨塵埃一起沉降入水中，還有的是隨垃圾、人畜糞便以及某些工業(yè)廢棄物進(jìn)入水體。某些病原微生物進(jìn)入水中之后，會(huì)對(duì)水體造成污染，引起傳染病的流行。而某些微生物則會(huì)導(dǎo)致水華、赤潮等現(xiàn)象，對(duì)水生動(dòng)植物的生存造成嚴(yán)重的威脅。
以上，我們對(duì)微生物的危害進(jìn)行了探究，接著我們應(yīng)該探討下微生物給人畜及自然界帶來(lái)的好處。
首先，我們應(yīng)該意識(shí)到不是所有的微生物都會(huì)給人類的健康造成威脅，某些微生物也是人類的好朋友。如1929年，青霉素的研究誕生。青霉素能抑制病菌細(xì)胞壁的形成，使菌體的新陳代謝失調(diào)，達(dá)到抑菌和殺菌的效用。之后科學(xué)家們有研制出了很多抗菌素類藥物，如鏈霉素、氯霉素、四環(huán)素、卡那霉素、慶大霉素、紅霉素等。還有一種叫正常菌群的微生物，他們的營(yíng)養(yǎng)來(lái)自宿主組織細(xì)胞的分泌液、脫落細(xì)胞，以及某些腔道中的食物碎屑和殘?jiān)取＞旱拇x產(chǎn)物除供給細(xì)菌自身利用外，一部分可以被宿主吸收利用。例如，過(guò)去外科醫(yī)生不太重視腸道正常菌群中的大腸埃希氏菌能合成B族維生素和維生素K的功能，所以在腸道手術(shù)后為避免發(fā)生感染，常用抗生素作預(yù)防性治療。
再者，并不是所有的微生物發(fā)酵和腐化現(xiàn)象都對(duì)人類的財(cái)產(chǎn)和健康造成危害的。抗生素、丁醇、維生素C以及一些風(fēng)味食品的制備等通過(guò)微生物發(fā)酵途徑生產(chǎn)的。以酸奶為例，利用乳酸菌發(fā)酵生產(chǎn)的酸牛乳其營(yíng)養(yǎng)全面、風(fēng)味獨(dú)特，比牛乳更易被人體消化、吸收和利用，許多乳酸菌本身的微生物特性及代謝產(chǎn)物使得酸牛乳具有良好的保健醫(yī)療功效，如雙歧桿菌及嗜酸乳桿菌等。它可以調(diào)節(jié)腸道的微生態(tài)平衡，抑制有害微生物的生長(zhǎng)，防止腹瀉的作用，降低膽固醇，提高機(jī)體的免疫力，減免乳糖不耐癥，促進(jìn)乳中蛋白質(zhì)和脂肪的消化，促進(jìn)人體對(duì)乳中鈣的吸收，增加維生素，改善礦物質(zhì)的代謝吸收，調(diào)節(jié)機(jī)體微量元素的平衡，抑制致病菌和抗感染，抗輻射作用，抗高血壓作用，抵抗衰老延長(zhǎng)壽命，抗變異原性和抗腫瘤作用，分解毒素，防癌抗癌，具有美容作用。在地球化學(xué)生物循環(huán)中，微生物的腐化和分解作用是關(guān)鍵的一環(huán)。微生物作為生產(chǎn)者完成的是無(wú)機(jī)有機(jī)化的過(guò)程，直接為更高級(jí)的消費(fèi)者提供營(yíng)養(yǎng)；作為分解者是更主要的方面，完成的是有機(jī)無(wú)機(jī)化的過(guò)程，這個(gè)過(guò)程在整個(gè)地球物質(zhì)化學(xué)循環(huán)過(guò)程中，一方面又清道夫的功能，是地球保持清潔和狀態(tài)的恢復(fù)；另一方面為其他的生產(chǎn)者和消費(fèi)者提供營(yíng)養(yǎng)。
如今，我們常�？梢詮暮芏嗟膱�(bào)刊雜志上看到關(guān)于生物技術(shù)處理環(huán)境污染物的報(bào)道。如利用微生物凈化污水。微生物通過(guò)自身的生命活動(dòng)可以解除污水的毒害作用，使污水得到凈化。利用微生物處理生活垃圾。借助EM復(fù)合菌劑的接種發(fā)酵，可以消除垃圾中的有害物質(zhì)，病原菌蟲(chóng)等，達(dá)到變廢為寶，有效解決了傳統(tǒng)的垃圾焚燒或者垃圾填埋所造成的能源損耗、空氣污染、土地污染和水污染的問(wèn)題。利用微生物治理大氣污染。微生物用于煙氣脫硫，不需高溫、高壓、催化劑，設(shè)備要求簡(jiǎn)單。利用自養(yǎng)生物脫硫，營(yíng)養(yǎng)要求低，無(wú)二次污染，處理費(fèi)用為濕法脫硫的50%。
從以上對(duì)微生物給人畜和自然界帶來(lái)的利和弊的討論，我們應(yīng)該時(shí)刻意識(shí)到,在我們的周圍和機(jī)體內(nèi)都有其他生命體與我們共存。對(duì)于那些對(duì)我們的生活造成威脅的微生物我們應(yīng)該時(shí)刻做好防備。既然我們已經(jīng)認(rèn)識(shí)到微生物是大部分傳染病的始作俑者，那么我們就要學(xué)會(huì)在源頭消滅它，在傳播途徑斷絕他。例如，注意個(gè)人衛(wèi)生，勤洗手；多鍛煉，增強(qiáng)自身抵抗力；到人多的地方要戴口罩；注意用藥，不濫用抗生素。既然我們已經(jīng)知道環(huán)境里彌漫的微生物時(shí)刻腐化著我們的食物，那么，我們應(yīng)該注意自己的飲食健康，如每餐盡量將食物吃完，少吃隔夜飯菜，不吃變質(zhì)的食品，科學(xué)妥善保存好儲(chǔ)糧。既然我們已經(jīng)知道了某些病原微生物會(huì)污染水質(zhì)，那么，政府部門(mén)應(yīng)該加強(qiáng)污水的管理，尤其是醫(yī)院污水等含有病原微生物的污水的管理，做好水質(zhì)處理工作和水源的衛(wèi)生保護(hù)，做好積水系統(tǒng)的維護(hù)和管理；作為個(gè)人，我們平時(shí)應(yīng)該注意不喝生水，飲用水應(yīng)該經(jīng)過(guò)嚴(yán)格過(guò)濾凈化并加熱燒開(kāi)方可飲用。
雖然人類與微生物的斗爭(zhēng)會(huì)無(wú)止境地持續(xù)下去，但只要我們充分認(rèn)識(shí)到我們所處的環(huán)境，利用我們現(xiàn)在的科學(xué)技術(shù)，正確對(duì)待微生物在人類健康中的作用，我們就可以減小微生物對(duì)人類的危害，讓微生物為人類服務(wù)。
微生物驗(yàn)證
土壤微生物的采集一般有土樣采集、增殖培養(yǎng)、培養(yǎng)分離、篩選最后進(jìn)行純種分離、毒性試驗(yàn)等。
1、采樣：
一般在有機(jī)質(zhì)較多的肥沃土壤中，微生物的數(shù)量最多，中性偏堿的土壤以細(xì)菌和放線菌為主，酸性紅土壤及森林土壤中霉菌較多，果園、菜園和野果生長(zhǎng)區(qū)等富含碳水化合物的土壤和沼澤地中，酵母和霉菌較多。選擇一定的土壤環(huán)境采集土樣，將采集到的土樣盛入清潔的聚乙烯袋、牛皮袋或玻璃瓶中。
2、增殖培養(yǎng)：
為了容易分離到所需的菌種,讓無(wú)關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加,可以通過(guò)配制選擇性培養(yǎng)基,選擇一定的培養(yǎng)條件來(lái)控制.例如碳源利用的控制,可選定糖,淀粉,纖維素,或者石油等,以其中的一種為唯一碳源,那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長(zhǎng),而其它微生物就可能死亡或淘汰.這樣對(duì)下階段的純種分離就會(huì)順利得多.
3、培養(yǎng)分離：
盡管通過(guò)增殖培養(yǎng)效果顯著,但還是處于微生物的混雜生長(zhǎng)狀態(tài).因此還必須分離,純化.在這—步,增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用,而且控制得細(xì)一點(diǎn),好一點(diǎn).純種分離的方法有劃線分離法,稀釋分離法.
4、篩選：
這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件,通過(guò)三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn),以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種。
關(guān)于菌種的識(shí)別，細(xì)菌、放線菌、酵母菌和霉菌，每一類微生物在一定培養(yǎng)條件下形成的菌落各具有某些相對(duì)的特征，利用觀察這些特征，來(lái)區(qū)分各大類微生物及初步識(shí)別、鑒定微生物。
土壤
一般取土壤表層5-10cm處土壤，如果土壤有翻動(dòng)，應(yīng)更深一點(diǎn)，避免空氣中微生物污染。
1、我們一般都用那種封口袋（塑料的），紙袋不容易保持水分。
2、當(dāng)天采當(dāng)天快遞回來(lái)，不用加冰袋。
3、快遞一般三天就到，對(duì)微生物菌群影響不大。
4、在冰柜中4度保存，時(shí)間不要超過(guò)一個(gè)月，盡量隨采隨做。菌株分離（seperation）就是將一個(gè)混雜著各種微生物的樣品通過(guò)分離技術(shù)區(qū)分開(kāi)，并按照實(shí)際要求和菌株的特性采取迅速、準(zhǔn)確、有效的方法對(duì)它們進(jìn)行分離、篩選，進(jìn)而得到所需的微生物的過(guò)程。
工業(yè)微生物產(chǎn)生菌的篩選一般包括兩大部分：一是從自然界分離所需要的菌株，二是把分離到的野生型菌株進(jìn)一步純化并迸行代謝產(chǎn)物鑒別。
菌種可從以下幾個(gè)途徑進(jìn)行收集和篩選：
（1）向菌種保藏機(jī)構(gòu)和個(gè)人索取有關(guān)的菌株，從中篩選所需菌株。國(guó)內(nèi)外著名的菌種保藏機(jī)構(gòu)有：美國(guó)典型菌種保藏中心（ATTC），英國(guó)國(guó)家典型菌種保藏所（NCTC），日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）等。
�。�2）由自然界采集樣品，如土壤、水、動(dòng)植物體等，從中進(jìn)行分離篩選。
�。�3）從一些發(fā)酵制品中分離回的菌株，如從醬油中分離蛋白酶產(chǎn)生菌，從酒糟中分離淀粉酶或糖化酶的產(chǎn)生曲等。該類發(fā)酵制品經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自然選樣，具有悠久的歷史，從這些傳統(tǒng)產(chǎn)品中容易篩選到理想的菌株。
菌株的分離和篩選一般可分為:采樣、富集、分離、產(chǎn)物鑒別、生化鑒定幾個(gè)步驟。
一、從土壤中采樣
1克土壤的含菌量大體有如下的遞減規(guī)律：細(xì)菌（108）＞放線菌（107）＞霉菌（106）＞酵母菌（105）＞藻類（104）＞原生動(dòng)物（103）
�。ㄒ唬└鶕�(jù)土壤特點(diǎn)
1．土壤有機(jī)質(zhì)含量和通氣狀況
采土樣最好的上層是5-25cm、一般每克上中含菌數(shù)約幾十萬(wàn)到幾十億個(gè)，并且各種類型的細(xì)菌和放線菌幾乎都能分離到�？偟膩�(lái)說(shuō)酵母菌分布土層最淺，約5-10cm；霉菌和好氧芽孢桿菌也分布在淺土層。
2．土壤的酸堿度和植被狀況
3．地理?xiàng)l件：南方、北方
4．季節(jié)條件：7-10月
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用取樣鏟，將表層5cm左右的浮土除去，取5-25cm處的土樣10-25g，裝入事先準(zhǔn)準(zhǔn)備好的塑料袋內(nèi)扎好、北方土壤干燥，在10-30cm處取樣。給塑料袋編號(hào)并記錄地點(diǎn)、土壤土質(zhì)、植被名稱、時(shí)間及其他環(huán)境條件。一般樣品取回后應(yīng)馬上分離。以免微生物死亡。但有時(shí)樣品較多，或到外地取樣，路途遙遠(yuǎn)，難以做到及時(shí)分離，則可采先用選擇性培養(yǎng)基做好試管斜面，隨身帶走。到一處將取好的土樣混勻，取3-4g撒到試管斜面上，這樣可避免菌株因不能及時(shí)分離而死亡。
二、根據(jù)微生物生理特點(diǎn)取樣
1．根據(jù)微生物的營(yíng)養(yǎng)類型
每種微生物對(duì)碳、氮源的需求不一樣，分布也有差異。若需要篩選代謝合成某種化合物的微生物，從大量使用、生產(chǎn)或處理這種化合物的工廠附近采集樣品，容易得到滿意的效果。不少微生物對(duì)碳源的利用是不完全專一的，如以油脂為碳源的某些脂肪酶產(chǎn)生菌同樣也可以分解淀粉獲得能源而生長(zhǎng)。
2．跟據(jù)微生物的生理特性
三、特殊環(huán)境下采樣
1．局部環(huán)境條件的影響
2．極端環(huán)境條件的影響
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