- 相關(guān)推薦
添加瓊脂改善木薯和糖蜜機(jī)械攪拌發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素的探究論文
細(xì)菌纖維素（bacterial cellulose，BC）是一種具有納米纖維結(jié)構(gòu)的微生物胞外聚合物，具有獨(dú)特的理化性質(zhì)和力學(xué)性能，如極強(qiáng)的持水性、高結(jié)晶度與高拉伸強(qiáng)度以及生物可降解性�；谝陨闲阅� BC 在許多領(lǐng)域具有應(yīng)用潛力，如保健食品、功能性紙張、紡織品、功能性材料、以及包括傷科敷料和人工血管在內(nèi)的生物醫(yī)學(xué)材料等。自然界中，能夠生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的微生物包括醋酸桿菌屬、根瘤菌屬、土壤桿菌屬、八疊球菌屬等。目前利用椰子水和木葡糖醋桿菌（Gluconacetobacter xylinus）在靜態(tài)培養(yǎng)條件下已實(shí)現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn)，但是存在以下問(wèn)題：1）由于近年對(duì) BC 的市場(chǎng)需求越來(lái)越大，椰子水資源已顯匱乏；2）靜態(tài)生產(chǎn)的低效和高成本極大地限制了 BC 的大規(guī)模生產(chǎn)與商業(yè)應(yīng)用。為了尋找新的價(jià)廉量大的生產(chǎn)原料以及提高效率和降低生產(chǎn)成本，研究者嘗試開發(fā)許多資源豐富的生物質(zhì)資源和利用發(fā)酵罐動(dòng)態(tài)生產(chǎn)。近期報(bào)道的生物質(zhì)資源包括魔芋粉、麥秸、稻稈、廢棄棉織物、廢紙漿和云杉等。
木薯（Cassava）是一種多年生木本灌木，其塊根呈肉質(zhì)，含有豐富的淀粉，作為經(jīng)濟(jì)類作物，主要用于加工淀粉和家用飼料。隨著國(guó)家能源戰(zhàn)略的實(shí)施，近年來(lái)木薯的應(yīng)用結(jié)構(gòu)發(fā)生了很大的變化，應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵中的比例迅速增加，特別是用于燃料乙醇的生產(chǎn)。糖蜜（Molasses）是制糖工業(yè)的副產(chǎn)物，呈黑褐色，組成成分中大部分為可發(fā)酵性糖。常見的糖蜜主要有甜菜糖蜜、甘蔗糖蜜、葡萄糖蜜以及玉米糖蜜等。雖然糖蜜中含糖量較高，但是其干物質(zhì)濃度大，灰分與膠體物質(zhì)多，所以在發(fā)酵應(yīng)用前需要進(jìn)行預(yù)處理，如硫酸預(yù)處理能使甜菜糖蜜的發(fā)酵產(chǎn)量得到明顯提高。前期工作中，本團(tuán)隊(duì)曾嘗試?yán)锰敲垤o態(tài)發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素并獲成功。
目前生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的主要方法為靜態(tài)培養(yǎng)，但是該法生產(chǎn)效率低，僅適合膜狀纖維素的小規(guī)模生產(chǎn)。相對(duì)而言，常規(guī)的機(jī)械攪拌發(fā)酵動(dòng)態(tài)培養(yǎng)可以控制多個(gè)參數(shù)，易于優(yōu)化工藝流程，更適合工業(yè)化生產(chǎn)，且易于在發(fā)酵企業(yè)推廣。但是機(jī)械攪拌發(fā)酵過(guò)程 中菌體對(duì)攪拌葉輪剪切力的高度敏感性，易變異退化，為此本團(tuán)隊(duì)曾報(bào)道了剪切力對(duì)木葡糖醋桿菌及細(xì)菌纖維素合成的影響。由此可見發(fā)酵過(guò)程中，剪切力與溶氧是影響菌體發(fā)酵效果的重要因素，剪切力小且溶氧率大是細(xì)菌纖維素生產(chǎn)菌的較佳發(fā)酵環(huán)境。常規(guī)液體深層機(jī)械攪拌發(fā)酵中若要增加溶氧，一般常用的增加轉(zhuǎn)速會(huì)帶來(lái)高剪切力，因此在剪切力與溶氧之間需要尋找到一個(gè)平衡點(diǎn)。本文分別以糖蜜與木薯為發(fā)酵碳源，考慮通過(guò)添加瓊脂來(lái)增加發(fā)酵液粘度以減小剪切力，在 3 L 機(jī)械攪拌發(fā)酵罐中研究不同濃度瓊脂對(duì)細(xì)菌纖維素生產(chǎn)的影響。
1 實(shí)驗(yàn)
1.1 菌體與原料
所用菌株 Gluconacetobacter xylinus ATCC 23770 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。接種在裝有固體培養(yǎng)基的試管中放于 4℃的冰箱中存放。使用時(shí)挑取菌落一環(huán)，置于三角瓶液體培養(yǎng)基中，于 30℃搖床 160 r/min 活化。木薯（華南五號(hào)）和糖蜜均購(gòu)自中國(guó)廣西。
1.2 原料預(yù)處理
糖蜜預(yù)處理（采用酸―熱處理法）：按糖蜜與去離子水 1∶4（w/w）的比例配置成約 1 L 糖蜜水溶液，經(jīng) 4 mol/LH2SO4調(diào) pH 值至 3，在 120℃溫度下熱處理 20 min，過(guò)夜，6 000 r/min 離心 20 min 后得到糖蜜預(yù)處理液。
木薯酶解液（采用兩步酶解法）：按去皮切塊的新鮮木薯與去離子水 1∶1.5（w/V）的比例加入高速粉碎機(jī)，在 22 000 r/min 速度下勻漿粉碎 5 min，先經(jīng)高溫α-淀粉酶水解（水解條件為酶用量 123 U/g、pH6.0、87.4℃、53 min）；待酶解液溫度降至室溫后再進(jìn)行糖化酶水解（水解條件為酶用量 133 U/g、pH4.5、62.2℃、86 min）。酶解完成后用干凈的八層紗布進(jìn)行過(guò)濾，濾液在 6 000 r/min 條件下離心 20 min，收集上清液，即得到木薯酶解液，以 DNS 法測(cè)定還原糖含量，并根據(jù)濃度進(jìn)一步配置發(fā)酵培養(yǎng)基。
1.3 培養(yǎng)基
斜面培養(yǎng)基包括葡萄糖 25 g/L、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 3 g/L、瓊脂 18 g/L。種子培養(yǎng)基除了不含瓊脂外，其它組分同斜面培養(yǎng)基。
糖蜜發(fā)酵培養(yǎng)基包括糖蜜預(yù)處理液 40 g/L（以還原糖計(jì)）、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 3 g/L。木薯發(fā)酵培養(yǎng)基包括木薯酶解液 40 g/L（以還原糖計(jì)）、蛋白胨 5 g/L、酵母粉 3 g/L。
所有培養(yǎng)基的初始 pH 值用 1 mol/L 硫酸和 1 mol/L 氫氧化鈉調(diào)至 5.0，并在 121℃下滅菌 20 min。
1.4 發(fā)酵罐培養(yǎng)
實(shí)驗(yàn)所用的 3 L 機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐由上海保興生物設(shè)備工程有限公司加工制造，該設(shè)備配有兩個(gè)擋板，有效工作體積 2 L，裝有兩個(gè)四葉斜槳（直徑 5 cm，上下共兩個(gè)，相距 10 cm），并配有溶氧電極（梅特勒-托利多公司）、pH 電極（梅特勒-托利多公司）和溫度電極，以及原位活細(xì)胞濃度在線分析儀（英國(guó) Aberinstruments 公司），分別用于測(cè)定溶解氧、pH 值、溫度和活菌濃度。
1.5 細(xì)菌纖維素的處理與測(cè)定
發(fā)酵液樣品經(jīng)過(guò)離心后，上清液用于測(cè)定還原糖含量，而含有絮狀纖維素的沉淀物用 1 mol/L NaOH在 85℃水浴鍋中堿煮 20 min，4 000 r/min 離心 15 min，然后用去離子水洗滌，再次離心，上述步驟重復(fù)兩次以去除纖維素中的菌體和殘留的培養(yǎng)基。
2 結(jié)果與討論
2.1 以木薯為原料添加瓊脂對(duì)細(xì)菌纖維素生產(chǎn)的影響
每12 h取樣測(cè)得的纖維素產(chǎn)量隨發(fā)酵時(shí)間的變化趨勢(shì)，圖3為發(fā)酵結(jié)束最終放罐的纖維素產(chǎn)量。圖 2 顯示當(dāng)發(fā)酵液中加入 0.2%的瓊脂時(shí)，纖維素合成速度最快，產(chǎn)量最高，在前 24 h 產(chǎn)量緩慢增長(zhǎng)，24 h后產(chǎn)量開始迅速增加，72 h后增長(zhǎng)放緩，96 h后纖維素產(chǎn)量基本不再增加，至發(fā)酵末纖維素產(chǎn)量達(dá)到7.3 g/L。加入 0.4%瓊脂的發(fā)酵液生產(chǎn)細(xì)菌纖維素的速度也較快，產(chǎn)量?jī)H次于前者。未加入瓊脂的發(fā)酵液無(wú)論合成纖維素的速度還是產(chǎn)量都是最低的，發(fā)酵產(chǎn)量由低到高依次為 0.0%＜0.8%＜0.6%＜0.4%＜0.2%，合成的纖維素產(chǎn)量依次為 6.1、6.5、6.8、6.9 和 7.3 g/L。該結(jié)果說(shuō)明適量的添加瓊脂可以提高纖維素的合成產(chǎn)量，但是隨著瓊脂量的增多，發(fā)酵液粘度可能過(guò)大會(huì)影響菌體的生長(zhǎng)，不利于纖維素的合成。由于發(fā)酵過(guò)程中絮狀纖維素會(huì)貼附在發(fā)酵罐內(nèi)壁以及葉片上導(dǎo)致纖維素產(chǎn)量的數(shù)據(jù)失真，所以在發(fā)酵結(jié)束后測(cè)定整體發(fā)酵液中的纖維素產(chǎn)量。
2.2 以糖蜜為原料添加瓊脂對(duì)細(xì)菌纖維素生產(chǎn)的影響
給出了纖維素產(chǎn)量隨時(shí)間的變化曲線。由圖 6 可知，在前 12 h 纖維素基本沒有合成，12 h 后開始緩慢合成，24 h 后合成速度加快，纖維素產(chǎn)量顯著提高，在 72 h 后纖維素的合成開始放緩，表明菌體已處于穩(wěn)定期至衰退期的過(guò)渡態(tài)，之后纖維素產(chǎn)量并未有明顯的增加。從單個(gè)曲線來(lái)看，加入 0.6%瓊脂的發(fā)酵液中纖維素產(chǎn)量在 48 h 后明顯高于其他組，最高產(chǎn)量達(dá) 6.5 g/L 左右，其次加入 0.4%與 0.8%瓊脂的發(fā)酵液中纖維素合成速度與終產(chǎn)量基本一致，沒有明顯的差異，而未加瓊脂發(fā)酵液中的纖維素產(chǎn)量從發(fā)酵初始至發(fā)酵終止一直落后于其他組，最終產(chǎn)量達(dá) 4.5 g/L 左右�？梢姯傊募尤肽苁棺罱K發(fā)酵產(chǎn)量明顯提高，與木薯的結(jié)果一致。發(fā)酵最終的纖維素產(chǎn)量，從高到低依次為 0.6%＞0.4%＞0.8%＞0.2%＞0.0%，產(chǎn)量依次為 7.4、6.3、6.0、5.7 和 4.8 g/L。
2.3 木薯與糖蜜發(fā)酵結(jié)果的比較
從單個(gè)碳源的發(fā)酵結(jié)果來(lái)看，木薯發(fā)酵液中當(dāng)加入 0.2%～0.6%的瓊脂時(shí)，無(wú)論從 BC 得率、產(chǎn)率還是菌濃等指標(biāo)來(lái)看，發(fā)酵結(jié)果都是最優(yōu)的，加入瓊脂后的發(fā)酵液中菌體生長(zhǎng)比添加前明顯加速，纖維素產(chǎn)量提高。糖蜜發(fā)酵液中當(dāng)加入 0.4%～0.8%的瓊脂后，各項(xiàng)發(fā)酵指標(biāo)均明顯提高，菌體濃度接近 2.0×106cells/mL，而未加瓊脂的發(fā)酵效果不理想，各項(xiàng)指標(biāo)均低于其它各組。剪切力是動(dòng)態(tài)發(fā)酵過(guò)程中的關(guān)鍵因素之一，增加發(fā)酵液粘度可以降低剪切力。Kouda 等在發(fā)酵液中添加了1%的 BC 懸浮物增加發(fā)酵液粘度后，BC 產(chǎn)量顯著增加。Bae 等在玉米漿―果糖培養(yǎng)基中添加瓊脂，結(jié)果顯示當(dāng)加入 0.4%的瓊脂時(shí) BC 產(chǎn)量最大，由未加入瓊脂的 8 g/L 提高到 12.8 g/L。
將兩種碳源進(jìn)行對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)，木薯的發(fā)酵性能明顯優(yōu)于糖蜜，菌濃基本都在 2.0×106cells/mL 以上，而糖蜜發(fā)酵液的菌濃則基本處于 2.0×106cells/mL 之下。終點(diǎn)糖濃也清晰的反映了這一問(wèn)題，木薯發(fā)酵終點(diǎn)糖濃基本處于 12～14 g/L 之間，而糖蜜發(fā)酵終點(diǎn)糖濃處于 14～20 g/L 之間，明顯高于前者，說(shuō)明糖蜜發(fā)酵的還原糖轉(zhuǎn)化率不高，因此纖維素合成量低于前者。兩種原料發(fā)酵結(jié)果的顯著差異可能在于糖蜜作為一種工業(yè)廢料，其中摻雜了大量的色素以及其它抑制物，一定程度上抑制了菌體的生長(zhǎng)。這需要在糖蜜預(yù)處理中進(jìn)行針對(duì)性設(shè)計(jì)和優(yōu)化。
3 結(jié)論
在機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐中，分別以相同還原糖濃度的木薯酶解液和糖蜜處理液作為發(fā)酵碳源，結(jié)果發(fā)現(xiàn)木薯水解液的發(fā)酵性能優(yōu)于糖蜜，BC 產(chǎn)量約高出 5%。為降低機(jī)械攪拌的剪切力，添加瓊脂可以改善木醋桿菌的生長(zhǎng)，顯著提高細(xì)菌纖維素的產(chǎn)量。0.2%和 0.6% 分別是木薯水解液和糖蜜處理液的最佳瓊脂添加量，BC 產(chǎn)量可以分別達(dá)到 8.1 g/L 和 7.4 g/L。
【添加瓊脂改善木薯和糖蜜機(jī)械攪拌發(fā)酵制備細(xì)菌纖維素的探究論文】相關(guān)文章：
探究機(jī)械設(shè)計(jì)過(guò)程中機(jī)械材料的選擇和應(yīng)用論文07-04
機(jī)械自動(dòng)化概念與運(yùn)用探究論文07-03
機(jī)械制造專業(yè)行動(dòng)導(dǎo)向教學(xué)探究論文07-03
機(jī)械加工表面質(zhì)量的影響因素與改善途徑論文07-03
機(jī)械制造與自動(dòng)化應(yīng)用探究?jī)?yōu)秀論文07-03
機(jī)電自動(dòng)化在機(jī)械制造中的運(yùn)用探究論文07-04
探究現(xiàn)代主義和室內(nèi)設(shè)計(jì)的關(guān)系論文07-03
起重運(yùn)輸機(jī)械鋼絲繩的選型與使用壽命探究論文07-03