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生物樣品的熒光觀察
一、實驗目的
1、初掌握熒光顯微鏡和激光共聚焦掃描顯微鏡的結(jié)構(gòu)、原理、使用方法及其在細胞生物學研究中的應用。
2、掌握生物材料的熒光染色和活體熒光蛋白的觀察方法。
3、了解激光共聚焦的原理。
二、實驗原理
1、某些物質(zhì)經(jīng)短波光照射后，分子被激活，吸收能量后呈激發(fā)態(tài)。其能量除部分轉(zhuǎn)換為熱量外，相當一部分則以波長較長的光能輻射出來，這種波長長于激發(fā)光的可見光稱為熒光。細胞內(nèi)的某些物質(zhì)經(jīng)過短波光照射后，可以發(fā)出自發(fā)熒光。在生物學研究中，能將發(fā)熒光的有機化合物-熒光染料與特定的細胞組分相結(jié)合，通過激發(fā)后產(chǎn)生的熒光對細胞組分進行定性和定位。
2、生物樣品的熒光觀察采用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡。熒光顯微鏡以波長較短的光為光源，照射被檢樣品，激發(fā)被檢物品內(nèi)的熒光物質(zhì)發(fā)出可見的熒光，通過物鏡和目鏡放大成像。激光共聚焦顯微鏡也是來觀察樣品中熒光分布狀況的。激光共聚焦顯微鏡是以激光為光源，在某一瞬間只用很小一部分光照明，通過檢測器的一個小孔或裂縫后成像，保證只有來自該焦平面的光成像，而來自焦平面外的散光則被小孔和裂縫擋住，成像異常清晰。此外，激光共聚焦顯微鏡可以在同一樣品的不同焦平面進行掃描得到不同焦平面的圖像，然后通過計算機重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)。
3、本實驗中微絲的熒光觀察采用熒光素標記的鬼筆環(huán)肽（phalloidin），鬼筆環(huán)肽可以專一的結(jié)合在聚合狀態(tài)的肌動蛋白絲上，起到穩(wěn)定微絲的作用。細胞核的觀察用DAPI（diamidino-2-phenylindole）染色。DAPI能與DNA雙螺旋的凹槽部分相互作用，從而與DNA雙鏈緊密結(jié)合。結(jié)合后產(chǎn)生的熒光基團的吸收峰358nm，而散射峰是461nm。而植物細胞的花粉管、篩板和胞間連絲含有胼胝質(zhì)成分，經(jīng)苯胺藍染色后，用紫外光激發(fā)，可以發(fā)出黃綠色熒光。
4、激光共聚焦掃描顯微鏡（laserscanningconfocalmicroscope，LSCM）原理：用激光作掃描光源，逐點、逐行、逐面快速掃描成像，掃描的激光與熒光收集共用一個物鏡，物鏡的焦點即掃描(轉(zhuǎn)載于:www.hnNscy.CoM:生物熒光)激光的聚焦點，也是瞬時成像的物點。由于激光束的波長較短，光束很細，所以共焦激光掃描顯微鏡有較高的分辨力，大約是普通光學顯微鏡的3倍。系統(tǒng)經(jīng)一次調(diào)焦，掃描限制在樣品的一個平面內(nèi)。調(diào)焦深度不一樣時，就可以獲得樣品不同深度層次的圖像，這些圖像信息都儲于計算機內(nèi)，通過計算機分析和模擬，就能顯示細胞樣品的立體結(jié)構(gòu)。
三、實驗材料、試劑和儀器
1、材料：煙草懸浮細胞、擬南芥、蠶豆
2、試劑：3.6%多聚甲醛、Pipes緩沖液、100nmAlexaFluo488phalloidin、DAPI染色液、0.1%苯胺藍
3、儀器：Olympus熒光顯微鏡、恒溫培養(yǎng)箱、移液器、載玻片、蓋玻片、鑷子
四、實驗內(nèi)容
（一）熒光標記觀察煙草懸浮細胞微絲骨架的分布
1、煙草懸浮細胞繼代培養(yǎng)。
MS培養(yǎng)基的基本成分：
MS無機鹽+KH2PO4200mg/L；煙酸10mg/L；維生素B11mg/L；
肌醇100mg/L；2，4-D0.1mg/L；蔗糖30g/L
在室溫、黑暗生長，120~130rpm
2、固定：取300μl細胞液放入離心管中，靜置沉降，3000rpm離心30s，吸出培養(yǎng)基，加入500μl3.6%多聚甲醛，固定20min。再吸出固定液，用Pipes緩沖液清洗三次，每次5min。
3、染色：3000rpm離心1min，吸凈緩沖液，加入100nmAlexaFluo488phalloidin50μl，37℃染色20min，洗去染色液，加入50μl緩沖液，吸取10μl直接進行封片。
4、熒光顯微鏡觀察：在藍光激發(fā)下進行觀察，檢測的發(fā)射光波長為510-530nm。
（二）DAPI染色檢測細胞核DNA
用鑷子夾住三朵不同發(fā)育時期的擬南芥的花，將花粉黏在載玻片上，加入20ulDAPI染色液染色3-5min。在紫外激發(fā)下用熒光顯微鏡觀察，檢測發(fā)射光為461nm。
（三）、苯胺藍染色觀察胞間連絲
撕取蠶豆葉片下表皮，用20μl0.1%苯胺藍染色3-5min后紫外激發(fā)下鏡檢。
五、實驗結(jié)果
（一）熒光標記觀察煙草懸浮細胞微絲骨架的分布
圖1煙草懸浮細胞微絲骨架形態(tài)（phalloidin標記，Olympus熒光顯微鏡，40×物鏡）
熒光顯微鏡下可以觀察到，煙草懸浮細胞呈現(xiàn)出不規(guī)則形狀，原因是培養(yǎng)之前去除了細胞壁。再培養(yǎng)一段時間后細胞壁再生，會有不同的形態(tài)。細胞中有一條綠色的絲狀結(jié)構(gòu)，即為微絲，細胞和附近顏色較深。微絲在細胞內(nèi)呈現(xiàn)三維空間分布，細胞核附近分布較多，經(jīng)查閱相關(guān)文獻，解釋為微絲在細胞內(nèi)起到固定位置的作用。
（二）DAPI染色檢測細胞核DNA
圖2擬南芥花粉粒（DAPI染色，Olympus熒光顯微鏡，40×物鏡）
A三細胞型花粉粒B兩細胞型花粉粒
擬南芥的花粉粒呈微藍色的透明狀，細胞核被染成藍綠色。一個細胞內(nèi)可以觀察到最多3個細胞核。
（三）、苯胺藍染色觀察胞間連絲
圖3蠶豆葉下表皮細胞胞間連絲（苯胺藍染色，Olympus熒光顯微鏡，40×物鏡）
A胞間連絲B熒光標記淬滅后的觀察效果
在紫外光激發(fā)的熒光顯微鏡下觀察，發(fā)現(xiàn)胞間連絲位于相鄰細胞之間的細胞壁上，呈現(xiàn)出綠色熒光。
六、分析與討論
1、在熒光標記觀察煙草懸浮細胞微絲骨架的分布實驗中，在藍光激發(fā)下，清晰的看到了發(fā)出綠色熒光的細胞骨架。同時，觀察到制片的背景較明亮，原因可能是phalloidin
染色后清洗不夠充分，導致殘留的phalloidin粘在載玻片上，發(fā)出熒光。同時本次實驗中在最后取樣階段細胞堆疊太多，導致微管組織顯色重疊，觀察不便。
2、在DAPI染色檢測擬南芥花粉的實驗中，看到部分花粉粒中都有三個明亮的發(fā)光點，判斷為三個細胞核。此外，還看到一些僅有兩個細胞核的花粉粒。我們知道成熟的擬南芥花粉為三細胞型。而兩細胞的花粉粒可能是尚未成熟或在當前視野下只能看兩個核。本實驗中出現(xiàn)的三核并不明顯，更多的是以雙核為主，三核現(xiàn)象也更多時候第三核并不完整，總結(jié)原因估計是在取樣階段采集的是尚未展開的花朵。
3、在苯胺藍染色觀察胞間連絲的實驗中，在紫外激發(fā)下，看到蠶豆下表皮細胞呈藍色，其中較為明亮的光點即為胞間連絲。但在觀察中，發(fā)現(xiàn)熒光很迅速的發(fā)生淬滅，給觀察和拍照帶來了很大困難。在本實驗中選擇兩人配合以解決問題。但是，通過查閱相關(guān)資料后，建議在制片的時候，加入適量的抗淬滅劑如p-phenylenediamine(PPD)、0.2%DABCO，來減慢熒光的淬滅速度。
七、思考題
1、結(jié)合本實驗，總結(jié)用于熒光觀察樣品的制備方法
根據(jù)生物樣品產(chǎn)生熒光的方式不同，往往分為以下三類：
（1）自發(fā)熒光：在生物的某些組織中，經(jīng)紫外線照射后能直接發(fā)射出熒光的稱為自發(fā)熒光或直接熒光。如植物組織中的葉綠素，經(jīng)紫外線照射后，即可發(fā)出紅色熒光；在400nm左右的激發(fā)光照射下，可直接觀察細胞壁纖維素所產(chǎn)生的綠色熒光等；一些具有GFP基因的生物編碼出的蛋白能發(fā)出綠色熒光。
對于這類樣品的觀察，我們可以直接取材在熒光顯微鏡下觀察，但要根據(jù)樣品的熒光特性選取合適的激發(fā)光和發(fā)射光。
（2）次生熒光：有些生物組織經(jīng)紫外光照射后，并不能發(fā)出熒光，但是它可以吸收某些熒光染料并與與之結(jié)合，也可以產(chǎn)生熒光，這種稱為次生熒光（或間接熒光）。如鬼筆環(huán)肽、DAPI等。
該方法就是采用常用的熒光染料染色，也是本實驗三種樣品的熒光標記方法。首先應該根據(jù)樣品選取能夠與之特異性結(jié)合的熒光染料，比如鬼筆環(huán)肽結(jié)合微絲、DAPI結(jié)合核DNA、甲苯胺藍結(jié)合胞間連絲的胼胝質(zhì)。隨后經(jīng)染色處理，根據(jù)染料的特異性選取適當波長的激發(fā)光和發(fā)射光在熒光顯微鏡下進行觀察。
（3）免疫熒光：這種染色法是利用抗原與抗體反應的原理，將熒光染料與抗體結(jié)合，然后將這種標記熒光染料的抗體再與相應抗原結(jié)合，即形成抗原、抗體復合物。經(jīng)一定波長的光激發(fā)后，即可發(fā)射出熒光。以此辨認抗原在組織細胞內(nèi)的分布狀況。這種方法被稱為免疫熒光或熒光抗體法。
該方法是一種更為間接地觀察生物樣品熒光的方法。其關(guān)鍵在于抗原-抗體反應的選取與設計。可以采用直接染色法，就是將熒光素直接與第一抗體結(jié)合，然后進行抗原-抗體反應；也可采用間接染色法，即將熒光素與第二抗體結(jié)合，此法需要進行兩次抗原-抗體反應。觀察時也需要注意調(diào)好光源，即選擇適當?shù)牟ㄩL的激發(fā)光和發(fā)射光的選取。
此外，激光共聚焦掃描顯微鏡也可用來觀察樣品中熒光分布狀況，其可以在同一樣品的不同焦平面掃描得到圖像，通過計算機重構(gòu)出樣品的三維結(jié)構(gòu)，成像清晰，具有立體感。
參考文獻
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【2】王金發(fā)，何艷明，劉兵.細胞生物學實驗教程（第2版）.北京：科學出版社，2011
【3】王幼群，陳立群，劉毅敏，杜中.細胞生物學實驗教程.中國農(nóng)業(yè)生物學生物學院細胞生物學教研組，2009
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