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真核細(xì)胞rna提取的實(shí)驗(yàn)報(bào)告
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一．原理
本方法利用鹽酸胍抑制RNA酶，勻漿裂解細(xì)胞，采用有機(jī)溶劑抽提去除蛋白質(zhì)。通過選擇性沉淀RNA分子去除DNA。
二．方法
1.樣品處理
�、沤M織樣品處理：取新鮮的組織樣品稱重后，剪碎成約1cm2的組織塊直接加入勻漿液中進(jìn)行RNA提取，或液氮中速凍-70℃保存。
�、瀑N壁培養(yǎng)細(xì)胞處理：用PBS洗細(xì)胞一次，吸干溶液后將培養(yǎng)板快速移至液氮中冷凍后轉(zhuǎn)到-70℃保存；或加入1ml勻漿至培養(yǎng)板中直接裂解細(xì)胞，然后將粘稠的裂解液進(jìn)一步勻漿。
�、菓腋∨囵B(yǎng)細(xì)胞處理：離心收集細(xì)胞，用PHS懸浮漂洗再田心收集，若不立即提取RNA，則可經(jīng)液氮速凍后轉(zhuǎn)至一70℃貯存?zhèn)溆谩?/p>
2．加l倍體積鹽酸胍勻漿液[至準(zhǔn)備好的樣品細(xì)胞中，高速勻漿1min。
3．勻漿液5000g，室溫離心10min。
4．將上清移至一個(gè)干凈離心管中，加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉（PH5.2），混勻，再加5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃放置至少2小時(shí)。
5．5000g0℃離心10分鐘沉淀核酸，棄上清液，室溫干燥。
6，每個(gè)提取RNA的組織或細(xì)胞樣品中，加入l0～15min鹽酸胍勻漿液Ⅱ，攪拌溶解。
7．加入2.5體積預(yù)冷的乙醇，立即充分混勻，-20℃至少放置2小時(shí)。
8．5000g0℃離心10分鐘沉淀核酸，去上清，室溫?fù)]發(fā)乙醇。
9．按每克組織細(xì)胞加5min的比例．分兩次加入0.02mol／LEDTA(pH8.0)先加1／2體積EDTA振蕩l～2分鐘，3000g離心2min．吸出上清．再加另一個(gè)1/2體積的EDTA振蕩l一2分鐘．合并兩次核酸溶解液。．
10．用等體積氯仿—正丁醇(4：1)抽提核酸溶液，5000g室溫離心l0min，5000g室溫離心10min。吸出上清至另一個(gè)干凈離心管中。
11．加3倍體積lmol／L乙酸鈉(PH7.0)混勻，-20℃放置1h以上，此時(shí)RNA將選擇地沉淀，而DNA仍為溶解狀況。
12．5000g，0℃離心20min，沉于管底的是RNA。
13．吸去上清，用4℃預(yù)冷的lmol／L乙酸鈉(pH7．0)漂洗RNA沉淀。然后20℃5000g，離心20分鐘�；厥誖NA。
14．盡量去除上清液。按每g組織細(xì)胞1m的比例加入RNA溶解液(0.2％SDS，0.5％mol／LEDTA，pH8.0)。注意：若有SDS沉淀析出．滴加0.11mol／LNaOH調(diào)溶液pH至7．5。
15．加入2倍體積冰預(yù)冷乙醇混勻，0℃放置至少2小時(shí)，5000g，4℃離心10分鐘，RNA沉淀用70％乙醇漂洗，短暫離心后，棄上清，室溫干燥蒸發(fā)乙醇。
16．用適當(dāng)小容積DEPC處理過的ddH2O溶解RNA沉淀，加入3倍體積乙醇，
-70℃保存RNA備用。用時(shí)．加入0.1體積的3mol／L乙酸鈉，混勻，120xxg，4℃離心回收RNA。
三.試劑
1．鹽酸胍勻漿液Ⅰ
成分：8mol／L鹽酸胍(分子量為95.6)，O．1mol／L乙酸鈉(pH5．2)，5mmol／L2—巰基乙醇，0.5％十二烷基肌氨酸鈉
配制方法：取191g鹽酸胍．加8.35m13mol／L乙酸鈉(pH5．2)和6．25ml0．2mol／L2—琉基乙醇溶液中，再加水至237．5ml，混勻后加12．5ml10％十二烷基肌氨酸鈉,振蕩混勻溶解。
2．鹽酸胍勻漿液Ⅱ
成分：8mol／L鹽酸胍(分子量力95.6),0.1mol／L乙酸鈉(pH5．2),1mmol／L2
—琉基乙醇，20mmol／LEDTA(pH8.0)
配制方法：取191g鹽酸胍，加日．35ml3mol／I。乙酸鈉(pH5．2)和1．25ml0．2mol
�。疞2—巰基乙醇溶液中，再加入10ml0.5mol／LEDTA(pH8.0)。加水至250ml混勻。
3.乙醇
4.70％乙醇
5.氯仿—正丁醇(4：l，體積比)
6.4mol／L乙醇鈉，pH7.0
7.3mol／L乙醇鈉，pH5.2
8.RNA溶解液
成分：O．2％SDS．0.05mol／LEDTA,pH8.0
四、說明
提取RNA時(shí)，要特別注意防止RNase的污染，所用玻璃器皿均應(yīng)用0.1％的二乙基焦碳酸鹽(diethylpyrocarbonate，DEPC)處理。塑料器材均使用一次性用品，并高壓滅菌處理，必要時(shí)，也可用0.1%DEPC處理。
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