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分子實(shí)驗(yàn)[優(yōu)秀范文]
學(xué)院：專業(yè)班級：課程：實(shí)驗(yàn)名稱：組員：實(shí)驗(yàn)日期：
一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?/strong>
1、學(xué)習(xí)與掌握利用ITS序列鑒定真菌的原理；
2、掌握用ITS序列鑒定真菌的方法有步驟。
二、實(shí)驗(yàn)原理
1、菌物是真核生物的重要類別，傳統(tǒng)的菌物分類以子實(shí)體形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)為分類基礎(chǔ)，由于部分菌物的子實(shí)體不易獲得，形態(tài)特征不易掌握，少數(shù)形態(tài)特征和生理生化指標(biāo)隨著環(huán)境的變化而不穩(wěn)定，是傳統(tǒng)的菌物鑒定工作困難或分類系統(tǒng)意見分歧。內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)ITS(internal transcribed space),位于5.8S和18S之間（ITS1）以及5.8S和28SrDNA之間(ITS2)，ITS1和ITS2常被合稱為ITS，并且5.8SRNA基因也被包括在ITS之內(nèi)。近年來，利用真核生物在rDNA的ITS區(qū)域既具保守性又在科、屬、種水平上均有特異性序列的特性，對ITS區(qū)進(jìn)行PCR擴(kuò)增、測序。隨著核糖體rDNA ITS序列分析技術(shù)在菌物研究中的應(yīng)用，一些分類地位不明確、親緣關(guān)系不清楚的物種通過該技術(shù)得到了解決，一些重要的菌物遺傳信息得到闡明。
2、ITS（Internal Transcribed Spacer）：內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)。是真菌核糖體RNA（rRNA）基因非轉(zhuǎn)錄區(qū)的一部分。用于真菌鑒定的ITS序列通常包括ITS1、5.8 S和ITS2。真菌ITS區(qū)域長度一般在650～750 bp(堿基對)。
ITS（Internal Transcribed Spacer）鑒定是指對ITS序列進(jìn)行DNA測序，通過將測序得到的ITS序列與已知真菌ITS序列比較，從而獲得未知真菌種屬信息的一種方法。
ITS鑒定的原理：rDNA上的5.8、18和28 SrRNA基因有極大的保守性,即存在著廣泛的異種同源性。而由于ITS區(qū)不加入成熟核糖體,所以ITS片段在進(jìn)化過程中承受的自然選擇壓力非常小,因此能容忍更多的變異。在絕大多數(shù)的真核生物中表現(xiàn)出了極為廣泛的序列多態(tài)性,即使是親緣關(guān)系非常接近的2個(gè)種都能在ITS序列上表現(xiàn)出差異,顯示最近的進(jìn)化特征。研究表明,ITS片段的進(jìn)化速率是18 S rDNA的10倍。這就是ITS序列在微生物種類鑒定和群落分析的理論基礎(chǔ)。ITS1和ITS2是中度保守區(qū)域,其保守性基本上表現(xiàn)為種內(nèi)相對一致,種間差異比較明顯。這種特點(diǎn)使ITS適合于真菌物種的分子鑒定以及屬內(nèi)物種間或種內(nèi)差異較明顯的菌群間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析。由于ITS的序列分析能實(shí)質(zhì)性地反映出屬間、種間以及菌株間的堿基對差異,此外ITS序列片段較小、易于分析,目前已被廣泛應(yīng)用于真菌屬內(nèi)不同種間或近似屬間的系統(tǒng)發(fā)育研究中。ITS的序列分析還有效地解決Lenti nul a、Suill us、Tuber、Cer at ocystis和Oi diodendron等真菌應(yīng)用形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行分類所引起的紛爭,彌補(bǔ)了傳統(tǒng)分類上的一些不足。
ITS 鑒定的方法學(xué)：真菌rDNA ITS序列分析用于真菌系統(tǒng)分類通常通過多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)實(shí)現(xiàn)。rDNA多復(fù)制的特性,有利于低濃度或被更高度降解的DNA樣品中ITS區(qū)域的擴(kuò)增。這有利于研究尚無任何rDNA序列資料的生物。根據(jù)這些基因上高度保守區(qū)段設(shè)計(jì)出通用引物,借助PCR技術(shù)擴(kuò)增rDNA的目的片段。PCR技術(shù)在真菌分類、鑒定中與直接測序法相結(jié)合有很大的優(yōu)越性[ 14] : ①只需少量的DNA,每次擴(kuò)增只需約0.1～10 ng;②可對DNA的2條鏈測序,從而減少錯(cuò)誤;③可利用總DNA的較粗制備品;④適合于自動測序儀進(jìn)行測序。
三、實(shí)驗(yàn)器材
1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測：
1)、儀器：離心機(jī)離心管移液槍(200μL、1000μL)槍頭研缽恒溫水浴鍋超凈工作臺瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)一次性手套凝膠成像系統(tǒng)
紫外分光光度計(jì)
2)、材料：真菌3)、試劑：
(1)、DNA提取液：0.2M Tris-HCl（pH 7.5），0.5M NaCl，0.01M EDTA，1％SDS
(2)、3M NaAc
(3)、TE：10 mmol/L Tris-HCl pH8.0，1 mmol/L EDTA
(4)、酚（pH8.0）:氯仿:異戊醇(25:24:1)
(5)、氯仿:異戊醇(24:1)(6)、異丙醇
(7)、無水乙醇
(8)、75%乙醇
(9)、加入巰基乙醇(10)、RNaseA
2、ITS片段的PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物電泳檢測：
1)、儀器：PCR熱循環(huán)儀瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)移液槍一次性手套2)、材料：真菌ITS片段3)、試劑：
（1）、引物：ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’(5’端引物)ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’(3’端引物)
�。�2）、ddH2O(2.5mM)
�。�3）、10×MgCl2緩沖液
�。�4）、DNA模板
�。�5）、脫氧核糖核酸聚合酶(Taq酶)
（6）、50×TAE貯存液
（7）、6×加樣緩沖液
�。�8）、100bpDNA ladder。
(9)、溴酚藍(lán)染料
3、ITS片段測序
1)、儀器：PCR熱循環(huán)儀高壓電泳儀測序用電泳槽制膠設(shè)備吸頭、與電泳玻璃相配的染色盤、小指管
2)、材料：ITS片段PCR擴(kuò)增產(chǎn)物3)、試劑：
藥品：三羥甲基氨基甲烷（Tris）乙二胺四乙酸(EDTA)硼酸尿素丙烯酰胺N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）過硫酸銨冰乙酸碳酸鈉（Na2CO3）甲醛硫代硫酸鈉硝酸銀（AgNO3）測序級Taq DNA聚合酶4種d/ddNTP混合液pGEM-3ZF(+)對照DNA 1μg/μL ITS4/ITS5正向引物粘合硅烷硅烷
溶液：
（1）、5×TBE：
Tris 13.5g硼酸6.9g EDTA 0.9g用雙蒸水定容至250mL
（2）、6%變性聚丙烯酰胺凝膠貯液：
尿素
63.06g
丙烯酰胺8.5g
N，N’-亞甲基雙丙烯酰胺0.45g 5×TBE 15mL用雙蒸水定容至150mL（用普通濾紙過濾后使用）。
4、BLAST比對、鑒定屬、種：
儀器：電腦及攜帶BLAST程序（基本局部相似性比對搜索工具）
5、進(jìn)化樹的繪制
儀器：電腦及攜帶MEGA軟件（分子進(jìn)化遺傳分析）
四、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及步驟
(一)、實(shí)驗(yàn)內(nèi)容：
1、大量真菌的準(zhǔn)備;
2、真菌總基因組DNA的提��；
3、真菌基因組DNA純度、濃度的檢測；
4、ITS片段的PCR擴(kuò)增；
5、ITS片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測；
6、ITS片段測序；
7、BLAST比對、鑒定屬、種。
(二)、實(shí)驗(yàn)步驟：
1、真菌總基因組DNA的提取及其純度、濃度的檢測：
�。�1）、準(zhǔn)備大量的真菌，然后去1g真菌，在液氮中迅速研磨成粉。
�。�2）、2%CTAB抽提緩沖液在65℃水浴中預(yù)熱；
(3)、在1.5mL離心管中加入65℃預(yù)熱的抽提液700μL。
(4)、加入巰基乙醇50μL，上下震蕩，使蛋白質(zhì)變性沉淀，65℃水浴40min，每隔10min振蕩混勻一次。
(5)、加入等體積（約750μL）的氯仿/異戊醇(24/1)混勻，除去蛋白質(zhì)，4℃平衡離心，10000rpm，10min。(6)、取上清（約750μL）到1.5mL離心管中，加1/5體積（約150μL）65℃預(yù)熱的CTAB/NaCl混勻，加入600μL的氯仿/異戊醇(24/1)混勻，4℃平衡離心，10000rpm，10min。
(7)、取上清，加等體積（約750μL）的CTAB沉淀液，顛倒混勻。65℃水浴30min至沉淀可見。4℃平衡離心，10000 rpm，10min后小心去上清。
(8)、沉淀用TE（0.5mL）溶解，加入等體積（約0.5mL）的酚/氯仿/異戊醇(25:24:1)抽提，4℃平衡離心，10000rpm，10min。
(9)、取上清加入2倍體積的無水乙醇（1mL），再加入1/10體積的NaAC（pH 5.2）約0.1mL。
(10)、-20℃冰箱1h，4℃平衡離心，12000rpm，10min，棄上清，用70%酒精清洗2次，濾紙吸去多余水分，超凈臺吹干。
(11)、0.05mL TE溶解，加入5μLRNA酶液37℃放置30min；(12)、吸取適量樣品于紫外分光光度計(jì)上檢測濃度與純度；
(13)、剩余的樣品置于-20℃保存待用。
2、ITS片段的PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物電泳檢測
ITS4：5’-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3’ ITS5: 5’-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3’
1)、PCR Amplification reaction system（PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系）（50μl）ddH2O 38.5μl 10×buffer with MgCl2(MgCl2緩沖液)5.0μl dNTPs(2.5mM)1.0μl Primer5’（5’端引物）2.0μl Primer3’（3’端引物）2.0μl DNA template（DNA模板）1.0μl Taq DNA polymerase(脫氧核糖核酸聚合酶)(5U/μl)0.5μl
2)、反應(yīng)程序如下：
（1）94℃ for 5 minutes denaturalization（94℃預(yù)變性5min）
�。�2）94℃ for 45 seconds denaturation（94℃變性45s）
�。�3）52℃ for 45 seconds annealing(52℃退火45s)
�。�4）72℃ for 1min30sec extension（72℃延伸90s）重復(fù)步驟(2)-(4)30次
�。�5）72℃ for 10 minutes final extension（72℃最后一次延伸10min）大概500bp左右
3)、取5μl進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，其余-20℃保存：
(1)、瓊脂糖凝膠：將50×TAE貯存液用蒸餾水稀釋成1×TEA電泳緩沖液，待用，按1%稱取適量瓊脂糖置于250mL錐形瓶中，加入對應(yīng)量1×TEA稀釋緩沖液，蓋上封口膜，以減少水分蒸發(fā)，放入微波爐里加熱沸騰，取出搖勻，使瓶壁上粘附的瓊脂糖全部溶解，反復(fù)3次，至瓊脂糖全部溶化，放置，待其稍冷卻。
(2)、膠板的制備：將制膠槽置于水平支持物上，選擇合適厚度和齒數(shù)的樣品梳，插上梳子。向冷卻至50-60℃的瓊脂糖凝膠液中加入溴化乙錠(EB)溶液數(shù)滴，搖勻，小心地倒入制膠槽內(nèi)，使膠液形成均勻的膠層。待膠完全凝固后，小心拔出梳子，將膠塊取出，至于已加入足量1×TEA電泳緩沖液的電泳槽內(nèi)。
(4)、加樣：取5μl樣品與2μl 6×加樣緩沖液混勻，用微量移液槍小心加樣品槽中，在第一個(gè)孔或最后一個(gè)上樣孔內(nèi)加入5μl的100bpDNA ladder。
(5)、電泳：接通電泳槽與電泳儀的電源，以5V/cm(約100V)電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)染料移動到距凝膠前沿1-2cm處，停止電泳。
(6)、成像：戴上一次性手套，在波長為254nm的紫外燈下觀察膠塊，DNA存在處顯示出肉眼可辨的桔紅色熒光條帶，用凝膠成像系統(tǒng)照相。
3、ITS片段測序
�。ㄒ唬y序反應(yīng)：
1.對于每組測序反應(yīng)，標(biāo)記四個(gè)0.5ml eppendorf管(G、A、T、C)。每管加入2ml適當(dāng)?shù)膁/ddNTP混合物(d/ddNTP Mix)。各加入1滴(約20ml)石蠟油，蓋上蓋子保存于冰上或4℃?zhèn)溆谩?/p>
2.對于每組四個(gè)測序反應(yīng),在一個(gè)eppendorf管中混合以下試劑：
�。�1）樣品反應(yīng)：
質(zhì)粒模板DNA 2.1pmol 5×測序緩沖液5ml引物4.5pmol無菌ddH2O至終體積16ml
�。�2）對照反應(yīng)
pGEM-3Zf(+)對照DNA(4mg)4.0ml
5×測序緩沖液5ml
ITS4/ITS5正向引物(4.5pmol)3.6ml
無菌ddH2 O至終體積16 ml
3.在引物/模板混合物(以上第2步)中加入1.0ml測序級Taq DNA聚合酶(5u/ml)。用吸液器吸動幾次混勻。
4.從第3步的酶/引物/模板混合物中吸取4ml加入每一個(gè)d/ddNTP混合物的管內(nèi)。
5.在微量離心機(jī)中離心一下，使所有的溶液位于eppendorf管底部。
6.把G、A、T、C 4個(gè)反應(yīng)管放入預(yù)熱至95℃的熱循環(huán)儀，先經(jīng)過95℃ 2min，然后進(jìn)入如下循環(huán)：
95℃ 30s變性42℃ 30s退火70℃ 1min延伸45-60個(gè)循環(huán)后，取出置于冰箱中
7.熱循環(huán)程序完成后，在每個(gè)小管內(nèi)加入3μl DNA測序終止溶液，在微量離心機(jī)中略一旋轉(zhuǎn)，終止反應(yīng)。
�。ǘ�、測序凝膠板的制備
1、玻璃板的處理：
�。�1）短玻璃板的處理
A.在1ml 95%乙醇, 0.5%冰乙酸中加入5ml粘合硅烷(Bind Silane),配成新鮮的粘合溶液。
B.用經(jīng)浸透新配的粘合溶液浸透的吸水棉紙擦拭仔細(xì)清洗過并已經(jīng)自然干燥的玻璃板,整個(gè)板面都必須擦拭。
C.4-5分鐘后,用95%乙醇單向擦玻璃板,然后略用力沿垂直方向擦拭。重復(fù)三次這一清洗過程,每次均須換用干凈的紙,除去多余的粘合溶液。
2、長版處理（換雙橡膠手套）
(1)、用浸透硅烷的吸水紙仔細(xì)擦邊玻璃板表面。
(2)、5-10min后，用浸透95%乙醇的干凈吸水紙輕輕擦去多余硅烷(硅烷不能過量，否則影響印染效果)。(3)、用0.4mm邊條裝配好，再用膠帶粘好，用夾子夾好以防滲漏。
(4)、將板呈40°角傾斜，按下面的比例直接混合溶液，然后用燒杯直接灌膠，或用50mL注射器注入，避免出現(xiàn)氣泡（氣泡出現(xiàn)，可敲擊玻璃板，使之排出）。
6%變性聚丙烯酰胺凝膠貯液90mL，四甲基乙二胺(TEMED)60μL，過硫酸胺90μL。灌滿后將鯊魚梳子背面插入液面5-6mm，將板放置20°角使之聚合。在室溫中約20min內(nèi)聚合（注意底部不要邊條，直接用膠帶封，否則邊條不易取出）。
3、測區(qū)產(chǎn)物凝膠電泳（凝膠灌制后2-24h后均可獲得良好結(jié)果）
(1)、去掉凝膠兩邊和底部膠帶紙，拔下鯊魚齒梳并轉(zhuǎn)過來用尖齒插入凝膠約1mm。將凝膠板安裝到電泳儀上，在電極上、下槽都倒入1×TBE電泳緩沖液，用吸管吹洗掉梳齒形成加樣孔中殘留的尿素，并去掉氣泡。
接穩(wěn)定電源，40cm膠以1300V預(yù)電泳20-30min，是凝膠加熱到60℃左右。
(2)、將G、A、T、C 4個(gè)小管，各加入3μLDNA測序反應(yīng)終止液，置于沸水中煮沸2min迅速插入冰中，上樣前，短暫離心混勻。
(3)、關(guān)閉電源，上樣4μL。
(4)、上樣后，繼續(xù)電泳，直至二甲苯藍(lán)染料距離玻璃板底部2cm時(shí)，終止電泳。
4、DNA測序凝膠的銀染法處理
(1)、玻璃板的分離：電泳結(jié)束后，小心揭開玻璃板，凝膠應(yīng)牢牢黏附在短板上。
(2)、凝膠的固定：將凝膠連同放入磁盤中，加入固定液，注意要沒過凝膠，放置20min直至溴酚藍(lán)和二甲苯藍(lán)的顏色消失。緩緩水平搖動。固定液可回收做定影液。
(3)、洗膠：用雙蒸水漂洗凝膠3次，每次2min。漂洗時(shí)輕輕搖動，每次前都將膠瀝干10-20s。
(4)、凝膠的染色：加入染色液緩緩搖動染色30min（25min后可在另一瓷盤中備好顯影液，同時(shí)要預(yù)冷到10℃）。
(5)、凝膠的漂洗：由于這一步非常關(guān)鍵，所以操作一定要非�？�。將染色液倒入一個(gè)容器內(nèi)，將瓷盤用雙蒸水涮一下，然后倒入3L雙蒸水，將凝膠浸入，然后將凝膠立即放入準(zhǔn)備好的預(yù)冷顯影液中（從膠浸入雙蒸水到放入顯影液不能超過5-10s，如超過則重復(fù)（4）（5）步）。
(6)、凝膠的顯影：緩緩搖動，直到凝膠上顯條帶，一般為5-6min，時(shí)間不要過長，否則背景會過深（邊搖動，邊觀察，棕褐色條帶到一定強(qiáng)度后，馬上終止）。
(7)、終止顯影：將等體積定影液直接加入顯影液，緩緩搖動2-3min（時(shí)間過長會使染色變淡）。
(8)、凝膠的漂洗：用雙蒸水漂洗2次，每次2min。
(9)、將凝膠放在空氣中干燥，識讀序列。
4、BLAST比對、鑒定屬、種
5、進(jìn)化樹的繪制
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