- 相關推薦
微生物限度檢查法標準操作規(guī)程
一、目的：建立微生物限度檢查的基本操作規(guī)程，為微生物檢查人員提供正確的操作規(guī)程。
二、適用范圍：適用于品管化驗室的微生物限度檢查。
三、職責：品管微生物檢驗員對本標準的實施負責。
四、正文：
1定義：微生物限度檢查法：系指非規(guī)定滅菌制劑及其原輔料受到微生物污染程度的一種檢查方法，包括染菌量及控制菌的檢查。2實驗用具：
電熱恒溫培養(yǎng)箱、電熱恒溫水溫箱、試管、刻度吸管、量筒、三角瓶、培養(yǎng)皿、試管架、注射器、針頭、注射器盒、研缽、75%酒精棉球、紫外燈（365nm波長）。
3培養(yǎng)基：
3.1營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、乳糖膽鹽培養(yǎng)基、蛋白胨水培養(yǎng)基。
3.2培養(yǎng)基的管理、配制應符合檢定菌、培養(yǎng)基管理規(guī)程、培養(yǎng)基配制規(guī)程。
4試液：甲基紅試液、a-奈酚乙醇試液、40%氫氧化鉀溶液、靛基質試液。
5稀釋劑：0.9%無菌氯化鈉溶液。
6供試品溶液的制備：取供試品（供試品如為固體，置研缽中研磨成細粉）放入試管中，加入適量的稀釋劑制成1：10濃度的供試品溶液。
7對照用菌液：控制菌檢查均應作相應已知菌的對照試驗，對照菌株為大腸桿菌[CMCC（B）441022]。取相應菌株的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基斜面新鮮培養(yǎng)物1白金耳，接種至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內，培養(yǎng)18-20小時，稀釋至1：106，對照菌的加入量為50-100個。
8檢查法：
8.1除另有規(guī)定外，細菌的培養(yǎng)溫度為30-35℃，霉菌的培養(yǎng)溫度為
25-28℃，控制菌的培養(yǎng)溫度為35±1℃。
8.2細菌、霉菌計數：
8.2.1平皿菌落計數法取均勻供試液，進一步稀釋成1：102、1：103等適宜的稀釋級。分別取連續(xù)三級10倍稀釋的供試液各1ml，置直徑約90mm的平皿中，再注入約45℃的培養(yǎng)基約15ml，混勻，等凝固后，倒置培養(yǎng)，每個稀釋級應作2~3個平皿。
營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基用于細菌計數，玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基用于霉菌計數。
8.2.2菌數測定陰性對照試驗取供試驗用的稀釋劑各1ml，置4個無菌平皿中，分別按細菌、霉菌計數用的培養(yǎng)基制備平板，培養(yǎng)，檢查，不得長菌。
8.2.3細菌培養(yǎng)時間為48小時，分別在24小時及48小時點計菌落數，一般以48小時菌落數為準，霉菌培養(yǎng)時間為72小時，分別在48小時及72小時點計菌落數，一般以72小時菌落數為準。菌落如蔓延生長成片，不宜計數。
8.2.4點計后，計算各稀釋級的平均菌落數，按菌數報告規(guī)則報告菌數。
8.2.5菌數報告規(guī)則：細菌宜選取平均菌落數在30-300之間的稀釋級，霉菌宜選取平均菌落數在30-100之間的稀釋級，作為報告菌數計算的依據。如只有1個稀釋級菌落數在30-300（30-100）
之間時，將該稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告，如同時有兩個稀釋級在30-300（30-100）之間時，按下式計算兩級比值。
比值=低稀釋級平均菌落數稀釋倍數
高稀釋級平均菌落數稀釋倍數
.當比值≤2時，以兩稀釋級的均值報告，當比值＞2時以低稀釋級平均菌落數乘以稀釋倍數報告，如同時有3個稀釋級的平均菌落數均在30-300（30-100）之間時，以后兩個稀釋級計算級間比值，如各稀釋級的平均菌落數均不在30-300（30-100）之間，以最接近30或300的稀釋級平均菌數乘以稀釋倍數報告，如各稀釋級平均菌落數均在300（100）以上，按最高稀釋級菌落數乘以稀釋倍數報告，如各
稀釋級平均菌落數均小于30時，一般按最低稀釋級的菌落數乘以稀釋倍數報告，如當1：10（1：100）稀釋級平均菌落數等于或大于原液（或1：10）時，應以培養(yǎng)基稀釋法測定，按測定結果報告菌數。
8.2.6培養(yǎng)基稀釋法：取供試液（原液或1：10供試液）3份，每份各1ml，分別注入5個平皿內（每皿各0.2ml）每個平皿中傾注營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基約15ml，混勻，凝固后倒置培養(yǎng)，計數，每1ml注入的5個平板點計的菌落數之和即為每1ml的菌落數，共得3組數據，以3份供試液菌落數的平均值乘以稀釋倍數報告。
如各稀釋級平板均無菌落生長，或僅最低稀釋級平均菌落數小于1時，則報告菌數為小于10個。
8.3控制菌檢查除另有規(guī)定外，取供試液10ml（相當于供試品1g、1ml、cm2），直接或處理后接種，經增菌、分離培養(yǎng)后，進行革蘭氏染色、生化試驗等項檢查。
8.3.1大腸菌群：
8.3.1.1檢樣稀釋及培養(yǎng)
①以無菌操作，將檢樣25g（ml）放于含有225ml滅菌生理鹽水的滅菌玻璃瓶內（瓶內預置適當數量的玻璃珠），經充分振搖或研磨做成1：10的均勻稀釋液。固體檢樣在加入稀釋液后，最好在均質器中以8000—10000r/min的速度處理1min，作成1：10的均勻稀釋液。
②用1ml滅菌吸管吸取1：10稀釋液1ml，沿管壁徐徐注入含有9ml滅菌生理鹽水的試管內（注意吸管尖不要接觸管內稀釋液），混合均勻，做成1：100的稀釋液。
�、哿砣�1ml滅菌吸管，按上述操作順序，做10倍遞增稀釋液。如此每次遞增稀釋一次，即換用一支1ml滅菌吸管。
④根據食品衛(wèi)生標準要求或標本污染情況的估計，選擇3個合適的稀釋度，每個稀釋度接種三管。
8.3.1.2乳糖發(fā)酵試驗
將待檢樣品接種于乳糖膽鹽發(fā)酵管內，接種量在1ml以上者，用雙
料乳糖膽鹽發(fā)酵管，
1ml及1ml以下者，用單料乳糖膽鹽發(fā)酵管。每一稀釋度接種三管，置36±1℃溫箱內，培養(yǎng)24±2h，如所有乳糖膽鹽發(fā)酵管都不產氣，則可報告為大腸菌群陰性，如有產氣者，則按下列程序進行。
8.3.1.3分離培養(yǎng)
將產氣的發(fā)酵管分別轉種在伊紅美藍瓊脂平板上，置36±1℃溫箱內，培養(yǎng)18~24h，然后取出，觀察菌落形態(tài)，并做革蘭氏染色和證實試驗。
8.3.1.4證實試驗
在上述平板上，挑取可疑大腸菌群菌落1~2個進行革蘭氏染色，同時接種乳糖發(fā)酵管，置36±1℃溫箱內，培養(yǎng)24±2h，觀察產氣情況。凡乳糖管產氣，革蘭氏染色為陰性的無芽孢桿菌，即可報告為大腸菌群陽性。
8.3.1.5報告：根據證實為大腸菌群陽性的管數，查MPN檢索表，報告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。
9結果判斷：
9.1細菌菌落數、霉菌菌落數、控制菌三項均符合該品種微生物限度項下的規(guī)定，應判為供試品符合規(guī)定；其中任何一項不符合該品種項下規(guī)定，應判供試品不符合規(guī)定。
9.2細菌菌落數、霉菌菌落數第一次測定超過該品種項下微生物限度規(guī)定時，應從同一批號樣品中隨機抽樣，復試兩次，以三次結果平均值報告。
9.3如營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板上生長霉菌菌落數或玫瑰紅鈉瓊脂培養(yǎng)基平板上生長細菌菌落數超過該品種項下微生物限度規(guī)定時，經復試2次，如3次結果平均值仍超過規(guī)定，應判為供試品不符合規(guī)定。
9.4各類制劑檢出控制菌或其他致病菌時，按第一次檢出結果為準，不再抽樣復試，即應判該供試品不符合規(guī)定。
【微生物限度檢查法標準操作規(guī)程】相關文章：
化學反應速率和限度07-09
化學反應的限度評課稿05-31
如何最大限度的占用網絡（寬帶）資源？07-10
微生物驗證07-27
兼顧“言”與“文”，最大限度發(fā)揮經典文本的教育功能06-19
常見微生物介紹03-19
奇妙的微生物作文07-11
微生物實驗總結07-07
微生物的產生及危害09-16