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論藥品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的建立論文
微生物污染是藥品質(zhì)量評(píng)估的重要指標(biāo)，目前各國(guó)藥典收錄的藥品無(wú)菌檢查和微生物限度檢查方法只對(duì)藥品終產(chǎn)品質(zhì)量進(jìn)行評(píng)價(jià)，且對(duì)無(wú)菌檢查不合格的藥品要求不得進(jìn)行復(fù)驗(yàn)。藥品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室如缺少對(duì)實(shí)驗(yàn)環(huán)境的監(jiān)督和控制，則無(wú)法評(píng)估微生物陽(yáng)性結(jié)果的污染來(lái)源。而藥品檢測(cè)過(guò)程中的微生物陽(yáng)性結(jié)果可能源于實(shí)驗(yàn)過(guò)程中環(huán)境的污染，因此判斷檢出菌與環(huán)境菌的相關(guān)性，是排除實(shí)驗(yàn)過(guò)程污染、減少假陽(yáng)性結(jié)果、提高檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性的必不可少的環(huán)節(jié)。同時(shí)現(xiàn)階段藥品安全管理仍存在監(jiān)管漏洞，當(dāng)藥品受到致病微生物污染時(shí)，往往出現(xiàn)定溯源難、應(yīng)變慢等問(wèn)題。若建立微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室日常的環(huán)境微生物菌庫(kù)，則可較好地解決上述問(wèn)題。目前國(guó)外通過(guò)分子生物學(xué)手段對(duì)病原微生物建庫(kù)的研究較多，如RIDOM website 提供根據(jù)16S DNA 序列的差異建立的病原微生物庫(kù)[4]。國(guó)內(nèi)對(duì)制藥環(huán)境建立環(huán)境微生物菌庫(kù)相關(guān)方面的研究也有報(bào)道，如PEI等[5]曾采用FTIR 法構(gòu)建潔凈室環(huán)境菌的FTIR 譜庫(kù)，但該方法對(duì)微生物的培養(yǎng)條件及預(yù)處理要求嚴(yán)格，隨機(jī)誤差也較大。目前在藥品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室建立環(huán)境微生物菌庫(kù)方面的研究仍較少。本研究從筆者工作的藥品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中不同部位、設(shè)備材料及活動(dòng)人員進(jìn)行連續(xù)7個(gè)月采樣收集微生物，共獲得248 株細(xì)菌和6 株霉菌，對(duì)收集的細(xì)菌采用全自動(dòng)微生物生化鑒定儀(Vitek2 Compact)進(jìn)行鑒定，對(duì)生化鑒定無(wú)確切結(jié)果的90 株細(xì)菌及6 株霉菌均采用3500 MicroSeq基因測(cè)序分析系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA 和霉菌LSU rDNA 測(cè)序鑒定，并對(duì)某次采樣收集獲得的6株金黃色葡萄球菌采用Diversilab 進(jìn)行同源性分析。通過(guò)對(duì)鑒定結(jié)果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境微生物庫(kù)，為今后本實(shí)驗(yàn)室微生物檢測(cè)結(jié)果污染溯源調(diào)查提供了信息保障，同時(shí)也為制藥企業(yè)開(kāi)展建立環(huán)境微生物信息庫(kù)和微生物污染溯源提供了技術(shù)指導(dǎo)。
1 材料與方法
1.1 儀器與試劑光學(xué)顯微鏡( 日本奧林巴斯) ; VITEK 2Compact 全自動(dòng)微生物生化儀、全自動(dòng)革蘭氏染色儀、Diversilab 同源性分析系統(tǒng)(法國(guó)梅里埃);梯度96 孔Verti PCR 儀(美國(guó)ABI 公司);PowerpacBasic 電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 公司);3500 MicroSeq全自動(dòng)微生物基因分析鑒定系統(tǒng)(美國(guó)ABI 公司)。
1.2 環(huán)境微生物的收集連續(xù)7 個(gè)月對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中不同部位、活動(dòng)人員及設(shè)備材料采用胰蛋白胨大豆瓊脂(廣東環(huán)凱)平板，分別通過(guò)接觸碟法(人員身上取樣)、浮游菌采樣器(環(huán)境浮游微生物取樣)、空氣沉降法(環(huán)境沉降微生物取樣)及棉簽擦拭法(設(shè)備和材料表面取樣)進(jìn)行微生物樣本采集，分離純化后共獲得248 株細(xì)菌和6 株霉菌，采用甘油凍存管置?70 ℃冰箱保存。
1.3 生化鑒定采用VITEK 2 Compact 對(duì)獲得的248 株細(xì)菌的新鮮培養(yǎng)物根據(jù)革蘭染色鏡檢結(jié)果選取GN、GP、BCL 不同鑒定試劑卡進(jìn)行生化鑒定。
1.4 細(xì)菌16S rDNA 及霉菌LSU rDNA 測(cè)序鑒定對(duì)VITEK 鑒定無(wú)確切鑒定結(jié)果的90 株細(xì)菌及6 株霉菌分別采用3500 MicroSeq 全自動(dòng)微生物基因分析鑒定系統(tǒng)進(jìn)行細(xì)菌16S rDNA 和霉菌LSU rDNA 測(cè)序鑒定。采用3500 MicroSeq 系統(tǒng)配套試劑對(duì)90 株細(xì)菌和6 株霉菌的TSA 平板培養(yǎng)物分別進(jìn)行DNA 抽提、PCR 擴(kuò)增和純化、標(biāo)記反應(yīng)及標(biāo)記反應(yīng)純化，最后進(jìn)行毛細(xì)管電泳測(cè)序。
1.5 6 株金黃色葡萄球菌的Diversilab 同源性分析某次采樣收集到6 株菌，采用VITEK 生化鑒定和16S rDNA 測(cè)序鑒定結(jié)果均為金黃色葡萄球菌，且在所測(cè)16S rDNA 基因片段中序列完全相同。為進(jìn)一步獲得6 株菌的分型信息，采用基于重復(fù)序列擴(kuò)增技術(shù)的Diversilab 同源性分析系統(tǒng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)6 株菌分別采用DiversiLab 儀器配套的金黃色葡萄球菌的rep-PCR 擴(kuò)增試劑盒先進(jìn)行擴(kuò)增，后吸取1 ?L PCR 產(chǎn)物加入芯片的標(biāo)本孔，進(jìn)行電泳分離擴(kuò)增的DNA的片段，采用儀器自帶軟件繪制基因分型同源性關(guān)系圖。
2 結(jié)果
2.1 菌株來(lái)源統(tǒng)計(jì)本次建庫(kù)收集到環(huán)境微生物分離菌株共計(jì)254 株，包括248 株細(xì)菌和6 株霉菌，所有的霉菌均來(lái)源于沉降菌收集。大部分菌株均來(lái)源于在微生物實(shí)驗(yàn)室活動(dòng)的人員(137 株)，占全部分離菌株的53.9%。其余環(huán)境沉降微生物(30 株)、環(huán)境浮游微生物(47 株)及來(lái)源于設(shè)備和材料表面的微生物(40 株)占全部分離菌株比例相差不大，分別為11.8%，18.5%和15.7%。
2.2 環(huán)境微生物菌庫(kù)的建立結(jié)合生化鑒定和測(cè)序鑒定結(jié)果的254 株微生物的鑒定結(jié)果統(tǒng)計(jì)見(jiàn)表1。其中葡萄球菌屬細(xì)菌最多，占全部分離菌的34.3%;其次為芽孢桿菌和微球菌，分別占全部分離菌的32.7%和12.6%。環(huán)境沉降菌和空氣浮游菌共收集到77 株微生物，占污染微生物總數(shù)的30.3%。其中，芽孢桿菌、葡萄球菌和藤黃微球菌均為常見(jiàn)環(huán)境菌。從設(shè)備材料和操作人員共收集分離表面微生物177 株，占污染微生物總數(shù)的69.7%。污染微生物比例最高的分別為芽孢桿菌屬、藤黃微球菌和表皮葡萄球菌，分別占表面微生物總數(shù)的29.9%、15.8%和14.1%。采用生化鑒定和測(cè)序鑒定2 種方法對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中收集到的254 株菌進(jìn)行鑒定，通過(guò)鑒定結(jié)果的整理和分析，初步建立了藥品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境微生物庫(kù)。
2.3 6 株金黃色葡萄球菌的同源性分析結(jié)果6 株金黃色葡萄球菌采用Diversilab 系統(tǒng)進(jìn)行同源性分析，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示6 株金黃色葡萄球菌高度同源，最低菌株間的親緣關(guān)系也達(dá)到99%(親緣關(guān)系>95%，即為同源)，所以6 株菌應(yīng)該來(lái)自同一個(gè)污染源。
3 討論
從建立的環(huán)境微生物庫(kù)各方面的對(duì)比情況分析可知，大部分微生物均來(lái)源于微生物實(shí)驗(yàn)室中活動(dòng)的人員。葡萄球菌屬和微球菌屬細(xì)菌為人體易攜帶污染的微生物，這兩類(lèi)微生物在多個(gè)采樣點(diǎn)均有發(fā)現(xiàn)，所以可能是由于人員活動(dòng)或表面接觸帶來(lái)的交叉污染，表明操作人員攜帶的微生物是實(shí)驗(yàn)室環(huán)境菌的主要來(lái)源之一，為了減少污染應(yīng)嚴(yán)格控制人員的更衣和清潔程序。環(huán)境中同樣存在著多種芽孢桿菌，在環(huán)境中不易被消毒滅菌，可能是由于消毒頻次和消毒劑效力問(wèn)題導(dǎo)致的殘留污染，應(yīng)該增加消毒滅菌頻率并有計(jì)劃地更換消毒劑確保杜絕污染。本研究通過(guò)7 個(gè)月的持續(xù)采樣收集環(huán)境微生物，初步建立了藥品微生物檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室的環(huán)境微生物庫(kù)，但是環(huán)境微生物庫(kù)的建立是個(gè)持續(xù)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，因此需要在日常監(jiān)測(cè)中不斷完善。本次建庫(kù)采用微生物鑒定(生化鑒定和測(cè)序鑒定)和分型技術(shù)(Diversilab 同源性分析系統(tǒng))對(duì)微生物實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行監(jiān)控，建立和健全了日常監(jiān)督檢查方法，為今后開(kāi)展污染水平的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估和不良事件調(diào)查提供技術(shù)平臺(tái)，同時(shí)也為高風(fēng)險(xiǎn)藥品生產(chǎn)企業(yè)建立環(huán)境微生物數(shù)據(jù)庫(kù)提供技術(shù)指導(dǎo)。
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