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分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)講義示例
CTAB法提取植物基因組DNA
【實(shí)驗(yàn)背景】
高等動(dòng)物，高等植物的基因組相當(dāng)龐大，一些物種的特定基因組包括了該物種生長(zhǎng)，發(fā)育，繁殖等各項(xiàng)生理活動(dòng)的幾乎全部信息量，因而對(duì)真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)，組成，以及表達(dá)調(diào)控的研究是至關(guān)重要的，而提取要求是獲得純度高和收得率高。
【實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/strong>
1、掌握植物材料基因組DNA的CTAB法提取分離基本原理的方法；
2、掌握微量移液槍、液氮研磨、微量試管、高速離心機(jī)等使用操作技術(shù)。
【實(shí)驗(yàn)原理】
植物組織采用液氮研磨達(dá)到細(xì)胞破碎，細(xì)胞內(nèi)容物采用CTAB分離蛋白質(zhì)、多糖，再有苯酚、氯仿、異戊醇混合液萃取純化，RNA由RNA酶消化，分離出的DNA由無水乙醇沉淀分離
【材料儀器】
材料：幼嫩的植物材料1.0g左右（紅葉石楠）
儀器：移液槍、電子天平、恒溫水浴箱、高速離心機(jī)、EP管、液氮、研磨等。
【實(shí)驗(yàn)試劑】
抽提緩沖液（2×CTAB溶液）：2％CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）、20mmol/LEDTA、1.4mol/L NaCL、1％β-巰基乙醇、
0.1％PVP（聚乙烯吡咯烷酮）、100mmol/L Tris-HCl（pH=8.0） TE: 10Mm Tris-HCl（pH=8.0），1mM EDTA
其他試劑：液氮、RNA酶、氯仿、異戊醇、CTAB、無水乙醇、苯酚、EDTA等
【實(shí)驗(yàn)操作】
取1.0g植物材料，雙蒸水洗凈，并用濾紙吸干 植物材料剪成0.5cm左右碎片，放入預(yù)冷的瓷研磨中。 加入液氮速冷，研磨成細(xì)粉（越細(xì)越好）。
轉(zhuǎn)入加有抽提緩沖液3.0ml的5ml離心管
60℃水浴保溫1小時(shí)（不時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)試管）
分裝成2個(gè)2.mlEP管，15,000 rpm，離心10分鐘
取上清轉(zhuǎn)入另一個(gè)新的離心管，加入等體積氯仿：異戊醇（24：1），混合均勻抽提至水乳膠融狀。
15,000 rpm離心5分鐘
上清液轉(zhuǎn)移到另一離心管中，加入0.8-1.0倍體積預(yù)冷異戊醇 ，-20℃保溫30分鐘－1小時(shí)，緩緩混勻DNA成絮狀折出
15,000 rpm，離心5分鐘，棄上清
DNA沉淀用冰冷的70％乙醇洗2次
揮發(fā)盡乙醇后，用200μl TE緩沖液溶解DNA，-20℃凍存。
【注意事項(xiàng)】
1、使用新鮮、幼嫩的材料，材料應(yīng)適量。
2、如果樣品容易呈粘稠狀，可能含有較多的多糖。
3、如果樣品溶液呈棕色，可能含有較多的酚類物質(zhì)。
4、操作過程中避免劇烈振蕩，器件、器皿和試劑需要高溫滅菌。
【思考題】
1、為什么要用新鮮、幼嫩的植物組織材料？
2、為什么在操作過程中避免劇烈振蕩？
3、為什么器件、器皿和試劑需要高溫滅菌？
4、如何提高提取植物組織DNA的產(chǎn)量？
苯酚：作為蛋白變性劑,同時(shí)抑制了DNase的降解作用.用苯酚處理勻漿液時(shí),由于蛋白與DNA 聯(lián)結(jié)鍵已斷,蛋白分子表面又含有很多極性基團(tuán)與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。
氯仿：也可使蛋白質(zhì)變性并加速有機(jī)相與液相分層。
異戊醇：有助于消除抽提過程中產(chǎn)生的氣泡。
CTAB法原理 CTAB(hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化銨)，是一種陽(yáng)離子去污劑,具有從低離子強(qiáng)度溶液中沉淀核酸與酸性多聚糖的特性。在高離子強(qiáng)度的溶液中(>0.7mol/L NaCl)，CTAB與蛋白質(zhì)和多聚糖形成復(fù)合物，只是不能沉淀核酸。通過有機(jī)溶劑抽提，去除蛋白，多糖，酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來
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