一、實驗原理

　　當(dāng)外界溶液濃度大于細(xì)胞液濃度時，根據(jù)擴(kuò)散作用原理，水分子會由細(xì)胞液中滲出到外界溶液中，通過滲透作用失水;由于細(xì)胞壁和原生質(zhì)層的伸縮性不同，細(xì)胞壁伸縮性較小，而原生質(zhì)層伸縮性較大，從而使二者分開;反之，外界溶液濃度小于細(xì)胞液濃度，則細(xì)胞通過滲透作用吸水，分離后的質(zhì)和壁又復(fù)原。

　　二、目的要求

　　1.初步學(xué)會觀察植物細(xì)胞質(zhì)壁分離和復(fù)原的方法;

　　2.理解植物細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離和復(fù)原的原理。

　　三、重點難點（實驗報告不寫這一點，可適當(dāng)調(diào)整添加在“注意”這一部分）

　　1.初步掌握植物細(xì)胞質(zhì)壁分離和復(fù)原的實驗方法;

　　2.臨時裝片的制作;

　　3.低倍顯微鏡的使用。實驗器材：紫色洋蔥的鱗片葉、刀子、鑷子、滴管、載玻片、蓋玻片、吸水紙（濾紙代替，濾紙可分為剪開幾條）、顯微鏡;

　　四、方法步驟

　　臨時裝片制作：

　　1選材：選用紫色特別深的洋蔥外表皮;說明：在實驗之前，最好將洋蔥放在水中浸泡一下，可以使洋蔥吸水多一些，而且代謝也比較旺盛，實驗效果明顯。

　　2：將洋蔥的外層剝?nèi)�兩層（因為處于最外的可能已�?jīng)死亡）。取表皮：在洋蔥的外表皮上，用刀片劃“井”字，用鑷子輕輕撕取一小塊;（關(guān)鍵：最好撕取單層細(xì)胞，如果撕的太厚，則會使細(xì)胞重疊，嚴(yán)重影響實驗效果;）

　　3制片：在載玻片中央滴上一滴純凈水，然后將取下的洋蔥表皮放在水中，輕輕展開。確保洋蔥表皮平整無卷曲，并且水中不能有氣泡。接著，將蓋玻片以45°角慢慢放置在載玻片上，確保清水充滿載玻片和蓋玻片之間的空間，使其擠出所有空氣。

　　4蓋玻片一端滴入糖水，于另一端用吸收紙重復(fù)幾次吸引（可重復(fù)幾次滴糖水和吸引的過程）。

　　質(zhì)壁分離實驗后可接著進(jìn)行質(zhì)壁復(fù)原

　　質(zhì)壁復(fù)原實驗

　　處理

　　取下臨時裝片，在一側(cè)滴入清水，另一側(cè)再用吸水紙重復(fù)幾次吸引，以確保洋蔥表皮細(xì)胞完全浸在幾乎是清水中;（注：無吸水紙可先用濾紙代替）

　　觀察

　　在低倍鏡下觀察到一個細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)了一個明顯的質(zhì)壁分離現(xiàn)象。細(xì)胞中央的液泡逐漸變大，顏色也變淺，最終細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞壁再次緊密結(jié)合在一起。如果質(zhì)壁分離沒有復(fù)原，那就說明外部溶液的'濃度過高，導(dǎo)致了細(xì)胞的死亡。根據(jù)以上觀察，得出以下總結(jié)：當(dāng)細(xì)胞內(nèi)液體的濃度小于外部溶液的濃度時，由于滲透作用，細(xì)胞會失去水分而發(fā)生質(zhì)壁分離現(xiàn)象；而當(dāng)細(xì)胞內(nèi)液體的濃度大于外部溶液的濃度時，細(xì)胞則通過滲透作用吸收水分，并發(fā)生質(zhì)壁分離的復(fù)原現(xiàn)象。

　　分離實驗特例

　　如果外界溶液包括葡萄糖、硝酸鉀、氯化鈉、尿素和乙二醇等物質(zhì)，當(dāng)細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)壁分離后，由于細(xì)胞主動或被動地吸收了溶質(zhì)微粒，導(dǎo)致細(xì)胞液濃度增加。這時，植物細(xì)胞會通過吸水使質(zhì)壁分離部分自動復(fù)原。

　　注：質(zhì)壁分離與復(fù)原結(jié)構(gòu)示意圖

生物實驗報告3

　　本學(xué)期第一次月考已經(jīng)結(jié)束，現(xiàn)將考試情況做如下分析：

　　一、基本情況：

　　本次月考試卷共有四個大題，考試內(nèi)容為第五單元第一、二章和第三章，最高分分，最低分分，平均分，及格率，優(yōu)秀率。此次考試包括選擇題、連線題、識圖題和實驗探究題。題型難易適當(dāng)，符合新課程考核要求，且試題涉及的內(nèi)容廣泛，有課本內(nèi)的，也涉及到課本外的知識。主要考查學(xué)生的觀察能力、分析能力、綜合能力及語言表達(dá)能力。

　　二、試卷結(jié)構(gòu)及試題賦分。

　　1、試卷的試題難易比為7：2：12、基礎(chǔ)知識和基礎(chǔ)技能考題內(nèi)容占75%左右。

　　3、試卷結(jié)構(gòu)較合理，難度適中，既考核學(xué)生對生物基礎(chǔ)知識和基本技能的掌握，同時也考查評價了學(xué)生的情感、態(tài)度、價值觀及學(xué)生的綜合應(yīng)用能力，符合八年級學(xué)生的認(rèn)知規(guī)律和能力梯度。

　　三、根據(jù)閱卷及考生成績情況分析：

　　第一大題單選題15分：考察基本概念和知識技能及學(xué)生身邊生活經(jīng)驗知識，失分主要在1、3、7、9、11等小題上。第二大題連線題10分，學(xué)生失分率較低，失分主要集中在2小題上，對于先天性行為和學(xué)習(xí)行為概念掌握不夠清晰。第三大題識圖題17分，失分較多的為第2題主要是學(xué)生對課本基礎(chǔ)知識掌握不牢，把生物知識應(yīng)用到生活經(jīng)驗上的能力較差。第四大題為實驗探究，在此次考試本題作為送分題，題目比較簡單，從本次考試結(jié)果來看，本題得分率在90%以上，達(dá)到了預(yù)期的目的。

　　四、對今后教學(xué)的反思。

　　1、教師要在平時多用教法激發(fā)學(xué)生學(xué)習(xí)生物的興趣，要重視“雙基知識”，即基礎(chǔ)知識和基本技能還要加強。

　　2、教師在教學(xué)中多和學(xué)生交流合作，把書本知識和生活經(jīng)驗多聯(lián)系，要重視培養(yǎng)學(xué)生收集資料歸納分析能力，訓(xùn)練語言表達(dá)能力。

　　3、教師注要重課本基礎(chǔ)知識點的教學(xué)，做好識圖填空題型。注重培養(yǎng)學(xué)生的實驗探究能力和應(yīng)用知識的能力。

　　4、學(xué)生的錯別字較多，教師要加強文字的書寫，尤其是一些概念或名稱中不經(jīng)常使用的文字的書寫。

　　5、教師在生物教學(xué)中要多重視過程教學(xué)及實驗教學(xué)，把平時的形成性評價做到實處，分組實驗及實驗習(xí)題要做認(rèn)真，實驗報告都要認(rèn)真填寫。養(yǎng)成學(xué)生觀察事物的.習(xí)性及分析歸納能力，培養(yǎng)創(chuàng)新思維的能力，使教學(xué)水平更上一層樓。

　　八年級生物實驗教學(xué)計劃

　　新的學(xué)期開始了，新學(xué)期有新的打算。對于我來說，這學(xué)期將是一個關(guān)鍵而忙碌的學(xué)期。

　　之所以說是一個關(guān)鍵而忙碌的學(xué)期，是因為我區(qū)八年級生物、地理要參加中考，我們不但要學(xué)習(xí)八年級下冊的知識，還要對四冊書進(jìn)行全面系統(tǒng)的復(fù)習(xí)，這學(xué)期時間又短，所以我們面臨很大的挑戰(zhàn)。除了做好自己的本職工作外，還要利用一切可利用的時間進(jìn)行學(xué)習(xí)，提高自己的業(yè)務(wù)能力。為了更好的利用時間，合理的安排教與學(xué)的進(jìn)度，現(xiàn)對本學(xué)期做如下計劃。

　　一、調(diào)整教學(xué)思路，提高學(xué)生成績;。

　　關(guān)于生物、地理等科目，學(xué)校一貫不夠重視，而這學(xué)期則不同，每周安排三課時來教學(xué)，可見任務(wù)之重，所以應(yīng)把提高學(xué)生的成績放在教學(xué)的首位。如果生物地理考不好，會影響到他們升初三后學(xué)習(xí)的動力。所以無論如何應(yīng)盡自己的最大努力，督促每一個同學(xué)，不管結(jié)果怎樣，都要努力拼搏三個多月。但我認(rèn)為要提高教學(xué)成績，最關(guān)鍵的是要調(diào)動學(xué)生學(xué)習(xí)的熱情，全身心的投入到學(xué)習(xí)中。正所謂：“知識是學(xué)會的，不是教會的。”所以在復(fù)習(xí)過程中，老師盡量少講或不講，讓學(xué)生充分的進(jìn)行小組之間的合作、討論和學(xué)習(xí)。生物課的復(fù)習(xí)一般都是分為幾部分內(nèi)容：

　　(1)知識點的歸納，這個可以讓學(xué)生課下整理;。

　　(2)知識點的分析，這個可讓學(xué)生分析，老師補充;。

生物實驗報告4

　　實驗一:練習(xí)使用顯微鏡

　　目的要求:

　　1.練習(xí)使用顯微鏡，學(xué)會規(guī)范的操作方法。

　　2.能夠獨立操作顯微鏡。

　　3.能夠?qū)��?biāo)本移動到視野中央，并看到清晰的圖象。

　　材料用具:顯微鏡，寫有“上”字的玻片，動、植物玻片標(biāo)本，擦鏡紙，紗布。

　　方法步驟

　　1.右手握住鏡臂，左手托住鏡座。

　　2．把顯微鏡放在實驗臺距邊緣7厘米左右處，略偏左。安裝好目鏡和物鏡。

　　3．動轉(zhuǎn)換器，使低倍物鏡對準(zhǔn)通光孔。

　　4．把一個較大的光圈對準(zhǔn)通光孔。一只眼注視目鏡內(nèi)，另一只眼睜開。轉(zhuǎn)動反光鏡，使光線通過通光孔反射到鏡筒內(nèi)。通過目鏡可以看到白亮的圓形視野。

　　5.把所要觀察的玻片標(biāo)本放在載物臺上，用壓片夾壓住，標(biāo)本要正對通光孔的中心。

　　6．轉(zhuǎn)動粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩緩下降，直到物鏡接近玻片標(biāo)本為止此時眼睛一定要看著物鏡）。

　　7．一只眼向目鏡內(nèi)看，同時逆時針方向轉(zhuǎn)動粗準(zhǔn)焦螺旋，使鏡筒緩緩上升直到看清物象為止。再略微轉(zhuǎn)動細(xì)準(zhǔn)焦螺旋，使看到的物象更加清晰。

　　8．練習(xí)將所觀察的標(biāo)本移到視野中央，先移動一下標(biāo)本，物象朝相反的方向移動。說明了在目鏡中看到的像是真實的像的倒像。

　　注意事項

　　實驗完畢，把顯微鏡的外表擦拭干凈。如需擦拭目鏡和物鏡，請用擦鏡紙。轉(zhuǎn)動轉(zhuǎn)換器，把兩個物鏡偏到兩旁，并將鏡筒緩緩下降到最低處。最后把顯微鏡放進(jìn)鏡箱里，送回原處。

　　討 論

　　1.顯微鏡的使用步驟有哪些？

　　答：1、取鏡和安放2、對光3、觀察（放片、調(diào)焦） 4、清潔與收鏡

　　2.使用顯微鏡觀察時，為什么在下降鏡筒時眼睛要注視物鏡？

　　答：物鏡把載玻片壓碎，也容易劃傷物鏡。

　　3.在顯微鏡下能看清寫在不透明紙上的“上”字嗎？

　　答：看不到，不透明的紙會阻擋光線從物鏡進(jìn)入光筒再從目鏡射出，所以可能什么也看不見。

　　實驗時間：20xx.9.15

　　實驗二:觀察植物細(xì)胞

　　實驗?zāi)康模?/p>

　　1、制作植物細(xì)胞的臨時裝片,學(xué)習(xí)制作臨時裝片的基本辦法.

　　2、認(rèn)識植物細(xì)胞等基本結(jié)構(gòu). 3、練習(xí)畫細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖.

　　實驗準(zhǔn)備：

　　分組實驗器材：顯微鏡、洋蔥、小刀、清水、滴管、吸水紙、載玻片、蓋玻片、鑷子、放大鏡等。

　　實驗過程：

　　一、制作洋蔥表皮玻片標(biāo)本

　　1、用潔凈地紗布把載玻片擦拭干凈。

　　2、把載玻片放在實驗臺上，用滴管在載玻片的中央滴一滴清水。

　　制作臨時裝片

　　3、用鑷子從洋蔥鱗片葉內(nèi)側(cè)撕取一小塊透明在膜——內(nèi)表皮。把撕下的內(nèi)表皮浸入載玻片的水滴中，用鑷子把它展平。

　　4、用鑷子夾起蓋玻片，是它的一邊先解除4載玻片上的水滴，然后緩緩地放下，蓋在要觀察的材料上，這樣才能避免蓋玻片下面出現(xiàn)氣泡而影響觀察。

　　染色

　　5、把一滴稀碘液滴在蓋玻片的一側(cè)。

　　6、用吸水紙從蓋玻片的另一側(cè)吸引，使染液浸潤標(biāo)本的全部。

　　三、觀察洋蔥表皮細(xì)胞

　　利用顯微鏡觀察洋蔥表皮細(xì)胞，先用低倍鏡下觀察，再在高倍鏡下觀察。

　　四、洋蔥鱗片葉表皮細(xì)胞圖。

　　五、實驗結(jié)束。

　　回收實驗器材，整理實驗桌。

　　實驗時間： 20xx.9.22

　　實驗三：觀察人體口腔上皮細(xì)胞

　　目的要求：

　　1. 制作和觀察人體口腔上皮細(xì)胞的臨時裝片

　　2. 認(rèn)識人體口腔上皮細(xì)胞的結(jié)構(gòu)

　　3. 熟練畫細(xì)胞結(jié)構(gòu)圖

　　材料用具：

　　顯微鏡、吸水紙、載玻片、蓋玻片、生理鹽水、碘液、鑷子、紗布、漱口杯、牙簽 方法步驟

　　(一) 制作人口腔上皮細(xì)胞的臨時裝片

　　1. 用紗布擦凈載玻片、蓋玻片（很薄，應(yīng)輕擦）

　　2. 在載玻片中央滴一滴生理鹽水（0.9%），說明：為什么用0.9%的生理鹽水，觀

　　察洋蔥表皮裝片用清水，都是為了讓細(xì)胞所處的環(huán)境和它們所生活的環(huán)境相同，

　　不至于脹破或變形，使細(xì)胞保持原狀。

　　3. 漱凈口。目的：將口腔的飯粒清除，以保證所取的細(xì)胞純度。

　　4. 用牙簽在口腔內(nèi)壁輕劃幾下，將上面附有碎屑涂抹在生理鹽水中，盡量涂均勻。

　　5. 蓋蓋玻片。用鑷子夾起蓋玻片，使它的一側(cè)先接觸載玻片的水滴，然后慢慢放

　　平（注意：避免產(chǎn)生氣泡）。

　　6. 染色。①在蓋玻片一側(cè)滴加稀碘液，②用吸水紙在蓋玻片另一側(cè)吸引，使染液

　　浸潤標(biāo)本的全部。

　　(二) 用顯微鏡觀察。

　　使用顯微鏡①安放②對光③放置玻片標(biāo)本，調(diào)節(jié)焦距，用眼觀察，在視野中會看到被染成桔黃色的上皮細(xì)胞.

　�。ㄈ�）繪圖：

　　人體口腔上皮細(xì)胞模式圖

　�。ㄋ模┱�理：清潔玻片，廢物放在指定位置。

　　歸納討論：人的口腔上皮細(xì)胞有哪些基本結(jié)構(gòu)，植物細(xì)胞和動物細(xì)胞相同和不同之處。 答：人的口腔上皮細(xì)胞的基本結(jié)構(gòu)有細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核；植物細(xì)胞與動物細(xì)胞相比，細(xì)胞壁、葉綠體和液泡是植物細(xì)胞特有的。

　　實驗時間： 20xx.9.27

　　實驗四：觀察人體的基本組織

　　目的`要求：

　　1．觀察人體基本組織的永久切片，認(rèn)識人體的四種基本組織；

　　2．描述同一種組織中細(xì)胞的共同特點；

　　3．描述不同組織中細(xì)胞形態(tài)上的不同之處；

　　4．根據(jù)觀察，概述組織的共同特點，形成組織的概念。

　　材料器具：

　　顯微鏡；扁平上皮、立方上皮、柱狀上皮等上皮組織玻片；橫紋肌、骨骼肌、心肌等肌肉組織玻片；骨、軟骨、血液、韌帶、肌腱、脂肪等結(jié)締組織玻片；神經(jīng)組織的玻片。

　　方法步驟：

　　1．根據(jù)教師提供的玻片，逐個在顯微鏡低倍鏡下認(rèn)真觀察，注意細(xì)胞的形態(tài)特征和細(xì)胞間的聯(lián)系特點。

　　2．根據(jù)觀察，同組間的同學(xué)互相討論，認(rèn)真填寫下表。

　　主要分布位組織類型 主要特征 功能 舉例 置

　　皮膚，消化 皮膚，小腸腺上皮組織 排列緊密形成表面 保護(hù)，分泌 道 上皮

　　四肢，軀 骨骼肌，平滑肌肉組織 呈長條狀緊密排列 干，內(nèi)臟器 收縮，舒張 肌 官

　　支持，連接， 軟骨，軟組結(jié)締組織 細(xì)胞之間間隙較大 全身各處 保護(hù)，營養(yǎng) 織，血液

　　產(chǎn)生傳導(dǎo)興神經(jīng)組織 形狀獨特呈發(fā)散狀 神經(jīng)系統(tǒng) 神經(jīng)纖維 奮

　　實驗時間：20xx.10.26

　　實驗五：觀察葉片結(jié)構(gòu)

　　目的要求:

　　1,練習(xí)徒手切片.

　　2認(rèn)識葉片的結(jié)構(gòu).

　　3畫葉片的表皮細(xì)胞和保衛(wèi)細(xì)胞圖.

　　材料用具:

　　新鮮葉片,顯微鏡,雙面刀片,鑷子,載玻片,蓋玻片,葉片的永久切片,盛有清水的培養(yǎng)皿,滴管,吸水紙,碘液,紗布,毛筆,小木板.

　　方法步驟:

　　一,練習(xí)徒手切片,制作葉片橫切片的臨時切片

　　1,把新鮮的葉片平放在小木板上.

　　2,右手捏緊并排的兩片刀片,沿著圖中虛線的方向,迅速切割.

　　3,刀片的夾縫中春游切下的薄片.要多切幾次(每且一次，刀片要咱蘸一下稅）。把切下的薄片放入水中。

　　4，用毛筆蘸出最薄的一片，制成臨時切片。

　　二，觀察葉片的結(jié)構(gòu)

　　1用顯微鏡先觀察葉片橫切面的臨時切片，再觀察葉片的永久橫切片。

　　2在顯微鏡下分清業(yè)的表皮，葉肉和葉脈。

　　三，觀察葉片的下表皮

　　1用鑷子撕下一小塊葉片（如蠶豆葉片的下表皮，制成臨時裝片。

　　2 用顯微鏡進(jìn)行觀察，看一看葉片下表皮的細(xì)胞是什么樣子的，下表皮上有沒有氣孔？下表皮氣孔多于上表皮。

　　四，實驗結(jié)果。

　　討論：保衛(wèi)細(xì)胞和它周圍的細(xì)胞在結(jié)構(gòu)上有什么不同？保衛(wèi)細(xì)胞的這種結(jié)構(gòu)特點對蒸騰作用有什么意義？

　　答：當(dāng)水分充足時,保衛(wèi)細(xì)胞膨脹張開,則氣孔張開,這時,蒸騰作用很強；當(dāng)水分不充足時,保衛(wèi)細(xì)胞收縮關(guān)閉,則氣孔關(guān)閉,這時,蒸騰作用變?nèi)�。保衛(wèi)細(xì)胞能夠控制氣孔開關(guān),所以也就能起到促進(jìn)或減緩蒸騰作用的意義。

　　實驗時間：20xx.12.5

生物實驗報告5

　　質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

　　姓名：XXX學(xué)號：2011001400XX年級：20xx級生物基地班 實驗日期：20xx年9月16日—30日組別：6組 同組者：XX

　　一、【實驗?zāi)康摹?/strong>

　　1、掌握堿變性提取法提取大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的原理和方法。

　　2、學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進(jìn)行DNA的分離純化的實驗原理。

　　3、學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。

　　4、學(xué)習(xí)并掌握凝膠中DNA的分離純化方法。

　　二、【實驗原理】

　　1、質(zhì)粒DNA的制備方法

　　質(zhì)粒（Plasmid）是獨立存在于染色體外、能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，但在細(xì)菌細(xì)胞中含量最多。細(xì)菌質(zhì)粒大小介于1～200Kb之間，是應(yīng)用最多的質(zhì)粒類群，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)它們利用宿主細(xì)胞的復(fù)制機構(gòu)合成質(zhì)粒自身的DNA。

　　質(zhì)粒DNA的制備包括3個步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。主要方法包括：堿裂解法：0。2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于質(zhì)粒大量提取。在實際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本實驗選擇堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

　　2、質(zhì)粒DNA的提取——堿變性提取法

　　在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶pH值不同。在pH值高達(dá)12。0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補鏈不完全分離。因為它們在拓?fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。當(dāng)用pH值4。6的KAc（NaAc）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀

　　DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。

　　3、凝膠電泳進(jìn)行DNA分離純化

　　電泳（electrophoresis）是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的速度可因電離子的大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA的片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。

　　凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠（ethidium bromide，EB）或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實驗。

　　分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸（5—500bp）的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長度上相差1bp或質(zhì)量上相差0。1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物，由β—D—吡喃半乳糖與3，6—脫水—L—吡喃半乳糖組成，相對分子質(zhì)量為104—105。瓊脂糖加熱至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點為40—45℃。瓊脂糖凝膠相對于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大（50至百萬bp），小片段DNA（50—20000bp）最適合在恒定輕度和方向的電場中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA的片段，進(jìn)一步純化DNA等。

　　瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶有負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的'電泳遷移率主要取決于6個因素：樣品DNA分子的大小、DNA分子的構(gòu)象、瓊脂糖濃度、電泳所用電場、緩沖液和溫度。

　　三、【實驗材料】

　　1、實驗儀器

　　培養(yǎng)皿、接種環(huán)、三角瓶、酒精燈、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、50ml離心管、1。5ml塑料離心管（Eppendorf管）、高速離心機、漩渦振蕩器、微量移液器、不同型號槍頭、天平、制膠槽、梳子、電泳儀、吸管、量筒、微波爐、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、試劑瓶、衛(wèi)生紙和記號筆、手套等。

　　2、實驗試劑

　　LB培養(yǎng)基，抗生素Ap（氨芐青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，預(yù)冷無水乙醇，TAE電泳緩沖液（10×），上樣緩沖液（6×），瓊脂糖，溴化乙錠（EB），DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5。2的醋酸鈉。

　　四、【實驗步驟】

　　1、準(zhǔn)備實驗

　　配制LB液體培養(yǎng)基，分裝到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固體培養(yǎng)基；準(zhǔn)備1000ul、200ul、10ul移液槍尖各一盒，1。5ml離心管若干于500ml三角瓶中，50ml離心管2個 ，將上述物品包好連同配好的培養(yǎng)基一同滅菌。

　　2、菌體培養(yǎng)

　　在含有Ap的LB平板上挑取一環(huán)攜帶有質(zhì)粒pUC19的E。coli DH5單菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃振蕩過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加Ap100ul

　�。�100ug/ml），質(zhì)粒pUC19具有Ap抗性基因，使得帶有pUC19的質(zhì)粒得以生長。 過夜培養(yǎng)后菌體量大，雜質(zhì)較多，然后用移液槍吸取過夜培養(yǎng)物2ml轉(zhuǎn)接于50mlLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入Ap250ul，37℃振蕩培養(yǎng)4—6h至對數(shù)生長期后期，生長速率快，代謝旺盛，酶系活躍，雜質(zhì)少，適合提取質(zhì)粒。

　　3、質(zhì)粒提取

　�。�1）稱量空的50ml離心管的重量為14。331g，然后將三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒?jié)M，液面距管口約1cm，7000rpm離心5分鐘后棄去上清液，收集菌體細(xì)胞。

　�。�2）向離心管中懸滴加入5ml冰預(yù)冷的溶液Ⅰ打散菌體洗滌，用漩渦振蕩器使之充分懸浮后用槍尖吹吸混勻，同步驟（1）離心，棄去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使上清液全部流盡干燥，然后稱重得14。437g，則菌體質(zhì)量為106mg。

　�。�3）洗滌后每100mg菌體應(yīng)加入冰預(yù)冷的溶液Ⅰ1ml，106mg菌體按100mg菌體處理，加入溶液Ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混勻，冰浴5min。溶液Ⅰ中的葡萄糖使

　　溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；維持滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂，防止DNA受機械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生長。Tris—Cl溶液提供適當(dāng)?shù)膒H。

　�。�4） 按比例加入新配制的溶液Ⅱ2ml（與溶液Ⅰ對應(yīng)），輕加輕搖，冰浴5min。溶液變清亮透明粘稠如蛋清狀。溶液Ⅱ中的NaOH使細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。同時，強堿性使染色體DNA、質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)變性；SDS為下一步沉淀做鋪墊。

　�。�5）按比例加入冰預(yù)冷的溶液Ⅲ1。5ml（與溶液Ⅰ、Ⅱ?qū)��?yīng)），輕加輕搖，冰浴10min。溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀。沉淀為蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物、細(xì)胞碎片和其他大分子成分。溶液Ⅲ中的HAc中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷基因組DNA，只要是50－100 kb大小的片斷，就不能再被PDS共沉淀。同時變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性。反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了沉淀。

　�。�6）12000rpm離心15min，白色沉淀聚集在離心管一側(cè)，用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到另一潔凈的離心管中。然后向上清液中加入1/10體積的3MNaAc混勻，加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。

　�。�7） 以12000rpm離心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，輕輕地覆蓋沉淀，不打散沉淀，洗滌一次。

　�。�8）以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。去掉上清液，將離心管上沉淀部位做好標(biāo)記，將離心管倒置于吸水紙上，干燥5min。粗提取的質(zhì)粒呈淺黃色，隨著水分的減少質(zhì)粒變?yōu)闊o色。所以為了完全溶解質(zhì)粒，要在離心管上標(biāo)記質(zhì)粒所在位置。

　�。�9）將DNA沉淀溶于1mlTE緩沖液中，移液槍吹吸助溶，然后將溶解液轉(zhuǎn)移到一個Eppendorf管中。TE是pH緩沖液，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對。同時含有EDTA是二價陽離子的螯合劑，抑制DNA酶作用。

　　4、質(zhì)粒純化

　�。�1）Eppendorf管中加入RNase A（純濃度＞50ug/ml），37℃保溫0。5—1h

　�。�2）將上述的溶液平均分配到2個1。5ml的微量離心管中，每管0。5ml，分別加入與溶液等體積的（500ul）Tris飽和苯酚溶液，振蕩混勻，7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是經(jīng)Tris飽和后的，顯黃色。苯

　　酚加入后，溶液分層，苯酚向下，下層呈淺黃色，上層溶液無色，在中間產(chǎn)生大量白色沉淀，此為變性后的蛋白質(zhì)。

　�。�3）加入等體積的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到到另一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是強的蛋白變性劑，但是苯酚留在質(zhì)粒溶液中會影響DNA的酶切，它本身易被氧化，會損傷質(zhì)粒。氯仿也是蛋白變性劑，但是比酚弱，且能溶解質(zhì)粒中的脂類，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫，有利于分層更明顯。此時溶液中已看不到明顯的白色沉淀，但仍有蛋白質(zhì)的存在。

　�。�4）加入等體積的氯仿溶液，振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中，得上清液400ul。

　�。�5）向上清液中加入1/10體積的NaAc混勻，再加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。

　�。�6）以12000rpm，離心15min，棄去上清液，得到DNA沉淀，為白色。

　�。�7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗滌。然后以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。

　�。�8）去掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，室溫干燥。用50ulTE溶解于1管中。

　　5、質(zhì)粒檢測

　�。�1）稱取0。4g的瓊脂糖，置于一錐形瓶中，在三角瓶上標(biāo)好液面位置，加入40ml的1×TAE電泳緩沖液，再加入5—10ml重蒸水，以補充在溶膠過程中損失的水分。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。冷卻至50℃左右，倒入制板槽制板。

　　（2）待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)加入1×TAE 電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面2—3cm。取1μl加電泳載樣液和3μl質(zhì)粒樣品于小紙片上，用移液槍混勻。

　�。�3）電泳1h，觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動。

　�。�4） 把膠槽取出，小心滑出膠塊，放進(jìn)EB溶液中進(jìn)行染色，完全浸泡約5min。

　�。�5）凝膠成像儀觀察。

　　五、【注意事項】

　�。�1）滴加溶液II時，要逐滴加入，且要輕加輕搖溶液使之混勻，整體動作要快，因為強堿在溶液中停留時間不能過長，否則會破壞質(zhì)粒DNA。

　�。�2）加入溶液III后，生成了大量的絮狀沉淀，溶液III中和強堿使質(zhì)粒復(fù)性，不可劇烈震蕩， 防止染色體DNA斷裂，應(yīng)該上下顛倒離心管，使其混勻。

生物實驗報告6