甘薯γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)基因的克隆和原核表達(dá)

　　學(xué)生： 學(xué)號：

　　同實(shí)驗者：

　　<研究背景>

　　谷胱甘肽(glutathione, GSH) GSH具有多種重要生理功能, 抗自由基和抗氧化應(yīng)激作用, 保護(hù)細(xì)胞膜的完整性等。γ-GCS是植物細(xì)胞中GSH生物合成的限速酶, 可以調(diào)控GSH的生物合成量。GSH在生物體抵御冷害、干旱、重金屬、真菌等脅迫過程中起著重要作用, 說明γ-GCS也與植物抗逆過程密切相關(guān)。

　　實(shí)驗一 甘薯葉片RNA提取

　　一、實(shí)驗?zāi)康?/p>

　　1. 了解真核生物RNA提取的原理；

　　2. 掌握Trizol提取的方法和步驟。

　　二、實(shí)驗原理

　　Trizol 試劑是由苯酚和硫氰酸胍配制而成的單相的快速抽提總RNA的試劑，在勻漿和裂解過程中，能在破碎細(xì)胞、降解細(xì)胞其它成分的同時保持RNA的完整性。TRIzol的主要成分是苯酚。苯酚的主要作用是裂解細(xì)胞，使細(xì)胞中的蛋白，核酸物質(zhì)解聚得到釋放。苯酚雖可有效地變性蛋白質(zhì)，但不能完全抑制RNA酶活性，因此TRIzol中還加入了8－羥基喹啉、異硫氰酸胍、β-巰基乙醇等來抑制內(nèi)源和外源RNase（RNA酶）。0.1%的8－羥基喹啉可以抑制RNase，與氯仿聯(lián)合使用可增強(qiáng)抑制作用。異硫氰酸胍屬于解偶劑，是一類強(qiáng)力的蛋白質(zhì)變性劑，可溶解蛋白質(zhì)并使蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)消失，導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)降解，核蛋白迅速與核酸分離。β-巰基乙醇的主要作用是破壞RNase蛋白質(zhì)中的二硫鍵。在氯仿抽提、離心分離后，RNA處于水相中，將水相轉(zhuǎn)管后用異丙醇沉淀RNA。用這種方法得到的總 RNA中蛋白質(zhì)和DNA污染很少。

　　三、實(shí)驗材料

　　1. 材料

　　甘薯（Ipomoea batatas Lam）葉片，品種為徐薯18

　　2. 試劑

　　① 無RNA酶滅菌水：加入0.01%的DEPC，處理過夜后高壓滅菌；

　�、� Trizol試劑；

　�、� 氯仿；

　�、� 異丙醇、75％乙醇；

　�、� TBE緩沖液；

　�、� 上樣緩沖液（6×）

　　3. 儀器

　　高壓滅菌鍋、微量移液器、臺式離心機(jī)、超凈工作臺、電泳儀、電泳槽、凝膠成像系統(tǒng)、1.5mL塑料離心管、槍頭和EP管架

　　四、實(shí)驗方法

　　1. 將葉片取出放入研缽中，加入適量液氮，迅速研磨成粉末，每50-100 mg植物葉片加入1 mL Trizol試劑，室溫放置5 min，使樣品充分裂解；

　　2. 每1 mL Trizol試劑加入200 μL氯仿，用手劇烈振蕩混勻后室溫放置3-5 min使其自然分相；

　　3. 4℃ 12,000 rpm 離心15 min，吸取上層水相轉(zhuǎn)移到新管中；在上清中加入等體積冰冷的異丙醇，室溫放置15 min；

　　4. 4℃ 12,000 rpm 離心10 min，棄上清，RNA沉淀于管底；

　　5. RNA沉淀中加入1 mL 75%的乙醇（用RNase-free水配制），溫和震蕩離心管，懸浮沉淀； 4℃ 8,000 rpm離心2 min，棄上清；

　　6. 室溫放置10 min晾干沉淀；

　　7. 沉淀中加入20μL RNase-free ddH2O，輕彈管壁，以充分溶解RNA，-70℃保存；

　　8. 用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，用EB染色并照相。

　　五、實(shí)驗結(jié)果

　　1. RNA提取結(jié)果

　　依照Trizol 試劑盒方法，提出的RNA較少，此部分未以圖或數(shù)據(jù)顯示。

　　2. RNA后電泳結(jié)果

　　如圖1. 其中9a為本組實(shí)驗結(jié)果。由圖可知RNA條帶非常模糊，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，幾乎無法分清具體條帶，亮度較大。點(diǎn)樣孔附近的紅色部分為雜質(zhì)，在提取過程中并未很好除去。

　　圖1. RNA提取跑膠結(jié)果。其中1泳道為樣品Marker，9a泳道為本小組RNA樣品。與標(biāo)準(zhǔn)對照可見條帶模糊，拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重。

　　六、分析與討論

　　1. RNA的提取

　　產(chǎn)量并不多，可能是因裂解樣品不充分或RNA沉淀未完全溶解所致。在實(shí)驗過程中，由于對操作時間的掌握不熟練、操作技巧不完善，留上清與棄上清時令RNA損失了部分，使最終RNA產(chǎn)量不理想。

　　2. RNA電泳結(jié)果

　　有EB存在時，電泳后28S rRNA和18S rRNA在紫外燈下應(yīng)看得很清楚，另出現(xiàn)條由tRNA，5.8S rRNA和5S rRNA組成的較模糊、遷移較快的帶。如果

　　RNA沒有降解，則28S rRNA的亮度應(yīng)為18S rRNA的2倍，且這兩條帶都無彌散現(xiàn)象發(fā)生。由圖1. 9a可知，RNA拖尾現(xiàn)象嚴(yán)重，說明RNA已大部分被降解；此外點(diǎn)樣孔附近出現(xiàn)紅色部分雜質(zhì)，分析可能有并未除盡的蛋白質(zhì)，同樣影響RNA電泳結(jié)果。

　　在進(jìn)行實(shí)驗時，本小組成員未嚴(yán)格戴上口罩并勤換手套，這可能使外源

　　RNAase進(jìn)入樣品，導(dǎo)致其降解嚴(yán)重。另外，提取出RNA后本小組未立即將樣品放入-70℃保存，也為導(dǎo)致結(jié)果不理想的重要原因之一。在最初用氯仿萃取分層的過程中，由于水相吸取過多，摻雜入部分蛋白質(zhì)雜質(zhì)而未于后續(xù)純化步驟除盡，RNA條帶拖尾嚴(yán)重可能還受該蛋白質(zhì)影響。

　　七、總結(jié)：

　　本次試驗RNA提取非常失敗，從跑膠結(jié)果可見其降解嚴(yán)重。雖然大實(shí)驗無法避免試劑交叉污染的可能性，且電泳用膠的質(zhì)量也會影響實(shí)驗結(jié)果，但從圖

　　1. 2a，3a，2b等條帶較為清晰的小組實(shí)驗結(jié)果可知，瓊脂糖凝膠質(zhì)量以及試劑對結(jié)果干擾不大。那么本小組成員在提取過程中的操作一定出現(xiàn)了很大失誤。首先口罩、手套應(yīng)該嚴(yán)格按規(guī)定佩戴，提取過程對移液槍等儀器使用需謹(jǐn)慎仔細(xì)，盡量避免混入雜質(zhì)。其次為排除部分雜質(zhì)影響可對RNA樣品用紫外線分光光度計測定吸光值檢驗，將有助于結(jié)果分析。最后，細(xì)節(jié)決定成敗，我們應(yīng)汲取教訓(xùn)避免接下來的實(shí)驗出現(xiàn)類似問題。

　　實(shí)驗二 第1鏈cDNA的合成和模板的驗證

　　一、實(shí)驗?zāi)康?/p>

　　1. 掌握第1鏈cDNA的'合成方法和步驟

　　二、實(shí)驗原理

　　真核生物基因多為斷裂基因，編碼區(qū)不連續(xù)，需經(jīng)轉(zhuǎn)錄后加工才能成為成熟mRNA。以真核成熟mRNA為模板合成cDNA，進(jìn)而獲得有連續(xù)氨基酸編碼的DNA序列，無需轉(zhuǎn)錄后加工，即可在原核細(xì)胞中表達(dá)。

　　真核生物的mRNA都有PolyA尾巴。引物：Oligo dT（12-18個T）。莫洛尼

　　氏鼠白血病毒逆轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV ）以單鏈RNA為模板，在引物的引發(fā)下合成與模板互補(bǔ)的DNA鏈（cDNA）。

　　mRNA 反轉(zhuǎn)錄生成的cDNA可作為PCR的模板進(jìn)行擴(kuò)增稱為RT-PCR，RT-PCR比Northern雜交更靈敏，對RNA的質(zhì)量要求較低，操作簡便，它是在轉(zhuǎn)錄水平上檢測基因時空表達(dá)的常用方法。

　　三、實(shí)驗材料

　　1. 材料

　　徐薯18葉片RNA樣品

　　2. 試劑

　�、� dNTP mixture（10 mM each）；

　�、� Oligo (dT) Primer (10 μM)；

　�、� Total RNA；

　　④ RNase free ddH2O；

　　⑤ M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶；

　　⑥ 5×First-strand Buffer；

　�、� 0.1 M DTT；

　　⑧ Ribonuclease Inhibitor (40 U/μL)

　　3. 儀器

　　10μL 和100μL 的移液槍、0.5mL的EP管、PCR儀等

　　四、實(shí)驗方法

　　1. 在RNase free Microtube 管中配制下列混合液：

　　dNTP mixture（10 mM each）1 μL

　　*Oligo (dT) Primer (10 μM) 4 μL

　　Total RNA2 μL

生物實(shí)驗報告8

　　質(zhì)粒DNA的提取、純化及檢測

　　姓名：XXX學(xué)號：2011001400XX年級：20xx級生物基地班 實(shí)驗日期：20xx年9月16日—30日組別：6組 同組者：XX

　　一、【實(shí)驗?zāi)康摹?/strong>

　　1、掌握堿變性提取法提取大腸桿菌中質(zhì)粒DNA的原理和方法。

　　2、學(xué)習(xí)并掌握凝膠電泳進(jìn)行DNA的分離純化的實(shí)驗原理。

　　3、學(xué)習(xí)并掌握凝膠的制備及電泳方法。

　　4、學(xué)習(xí)并掌握凝膠中DNA的分離純化方法。

　　二、【實(shí)驗原理】

　　1、質(zhì)粒DNA的制備方法

　　質(zhì)粒（Plasmid）是獨(dú)立存在于染色體外、能自主復(fù)制并能穩(wěn)定遺傳的一種環(huán)狀雙鏈DNA分子，分布于細(xì)菌、放線菌、真菌以及一些動植物細(xì)胞中，但在細(xì)菌細(xì)胞中含量最多。細(xì)菌質(zhì)粒大小介于1～200Kb之間，是應(yīng)用最多的質(zhì)粒類群，在細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)它們利用宿主細(xì)胞的復(fù)制機(jī)構(gòu)合成質(zhì)粒自身的DNA。

　　質(zhì)粒DNA的制備包括3個步驟：①培養(yǎng)細(xì)菌，使質(zhì)粒DNA大量擴(kuò)增；②收集和裂解細(xì)菌；③分離和純化質(zhì)粒DNA。主要方法包括：堿裂解法：0。2molNaOH+1%SDS；煮沸裂解法：沸水煮沸40秒；SDS裂解法：10%SDS，一般用于質(zhì)粒大量提取。在實(shí)際操作中可以根據(jù)宿主菌株類型、質(zhì)粒分子大小、堿基組成和結(jié)構(gòu)等特點(diǎn)以及質(zhì)粒DNA的用途進(jìn)行選擇。本實(shí)驗選擇堿裂解法提取質(zhì)粒DNA。

　　2、質(zhì)粒DNA的提取——堿變性提取法

　　在細(xì)菌細(xì)胞中，染色體DNA和質(zhì)粒DNA均被釋放出來，但是兩者變性與復(fù)性所依賴的溶pH值不同。在pH值高達(dá)12。0的堿性溶液中，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性；共價閉合環(huán)狀質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵斷裂，但兩條互補(bǔ)鏈不完全分離。因為它們在拓?fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。當(dāng)用pH值4。6的KAc（NaAc）高鹽溶液調(diào)節(jié)堿性溶液至中性時，變性的質(zhì)粒DNA可恢復(fù)原來的共價閉合環(huán)狀超螺旋結(jié)構(gòu)而溶解于溶液中；但染色體DNA不能復(fù)性，而是與不穩(wěn)定的大分子RNA、蛋白質(zhì)—SDS復(fù)合物等一起形成纏連的、可見的白色絮狀沉淀。這種沉淀通過離心，與復(fù)性的溶于溶液的質(zhì)粒DNA分離。溶于上清液的質(zhì)粒DNA，可用無水乙醇和鹽溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA和RNA性質(zhì)類似，乙醇沉淀

　　DNA的同時，也伴隨著RNA沉淀，可利用RNaseA將RNA降解。質(zhì)粒DNA溶液中的RNaseA以及一些可溶性蛋白，可通過酚/氯仿抽提除去，最后獲得純度較高的質(zhì)粒DNA。

　　3、凝膠電泳進(jìn)行DNA分離純化

　　電泳（electrophoresis）是帶電物質(zhì)在電場中向著與其電荷相反的電極方向移動的現(xiàn)象。各種生物大分子在一定pH條件下，可以解離成帶電荷的離子，在電場中會向相反的電極移動。凝膠是支持電泳介質(zhì)，它具有分子篩效應(yīng)。含有電解液的凝膠在電場中，其中的電離子會發(fā)生移動，移動的速度可因電離子的'大小形態(tài)及電荷量的不同而有差異。利用移動速度差異，就可以區(qū)別各種大小不同的分子。因而，凝膠電泳可用于分離、鑒定和純化DNA的片段，是分子生物學(xué)的核心技術(shù)之一。

　　凝膠電泳技術(shù)操作簡單而迅速，分辨率高，分辨范圍廣。此外，凝膠中DNA的位置可以用低濃度熒光插入染料如溴化乙錠（ethidium bromide，EB）或SYBR Gold染色直接觀察到，甚至含量少至20pg的雙鏈DNA在紫外激發(fā)下也能直接檢測到。需要的話，這些分離的DNA條帶可以從凝膠中回收，用于各種各樣目的的實(shí)驗。

　　分子生物學(xué)中，常用的兩種凝膠為瓊脂糖（agarose）和聚丙烯酰胺凝膠。這兩種凝膠能灌制成各種形狀、大小和孔徑，也能以許多不同的構(gòu)型和方位進(jìn)行電泳。聚丙烯酰胺凝膠分辨率高，使用于較小分子核酸（5—500bp）的分離和蛋白質(zhì)電泳。它的分辨率非常高，長度上相差1bp或質(zhì)量上相差0。1%的DNA都可以彼此分離，這也是采用聚丙烯酰胺凝膠電泳進(jìn)行DNA序列分析的分子基礎(chǔ)。雖然它能很快地進(jìn)行電泳，并能容納較大的DNA上樣量，但是與瓊脂糖凝膠相比，在制備和操作上繁瑣。瓊脂糖是從海藻中提取的長鏈狀多聚物，由β—D—吡喃半乳糖與3，6—脫水—L—吡喃半乳糖組成，相對分子質(zhì)量為104—105。瓊脂糖加熱至90℃左右，即可溶化形成清亮、透明的液體，澆在模版上冷卻后形成凝膠，其凝固點(diǎn)為40—45℃。瓊脂糖凝膠相對于聚丙烯酰胺凝膠分辨率低，但它的分離范圍更大（50至百萬bp），小片段DNA（50—20000bp）最適合在恒定輕度和方向的電場中水平方向的瓊脂糖凝膠內(nèi)電泳分離。瓊脂糖凝膠電泳易于操作，適用于核酸電泳，測定DNA的相對分子質(zhì)量，分離經(jīng)限制酶水解的DNA的片段，進(jìn)一步純化DNA等。

　　瓊脂糖凝膠電泳是一種常用的方法。在溶液中，由于核酸有磷酸基而帶有負(fù)電荷，在電場中向正極移動。DNA在瓊脂糖凝膠中的電泳遷移率主要取決于6個因素：樣品DNA分子的大小、DNA分子的構(gòu)象、瓊脂糖濃度、電泳所用電場、緩沖液和溫度。

　　三、【實(shí)驗材料】

　　1、實(shí)驗儀器

　　培養(yǎng)皿、接種環(huán)、三角瓶、酒精燈、恒溫振蕩培養(yǎng)箱、50ml離心管、1。5ml塑料離心管（Eppendorf管）、高速離心機(jī)、漩渦振蕩器、微量移液器、不同型號槍頭、天平、制膠槽、梳子、電泳儀、吸管、量筒、微波爐、滅菌鍋、恒溫水浴鍋、試劑瓶、衛(wèi)生紙和記號筆、手套等。

　　2、實(shí)驗試劑

　　LB培養(yǎng)基，抗生素Ap（氨芐青霉素），溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNaseA母液，TE緩沖液，飽和酚，氯仿/異戊醇混合液，酚/氯仿/異戊醇（PCI）混合液，預(yù)冷無水乙醇，TAE電泳緩沖液（10×），上樣緩沖液（6×），瓊脂糖，溴化乙錠（EB），DNA相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DNA Marker λ/Hind Ⅲ，5mol/L pH 5。2的醋酸鈉。

　　四、【實(shí)驗步驟】

　　1、準(zhǔn)備實(shí)驗

　　配制LB液體培養(yǎng)基，分裝到100ml的三角瓶中20ml，300ml的三角瓶中50ml，另配LB固體培養(yǎng)基；準(zhǔn)備1000ul、200ul、10ul移液槍尖各一盒，1。5ml離心管若干于500ml三角瓶中，50ml離心管2個 ，將上述物品包好連同配好的培養(yǎng)基一同滅菌。

　　2、菌體培養(yǎng)

　　在含有Ap的LB平板上挑取一環(huán)攜帶有質(zhì)粒pUC19的E。coli DH5單菌落，接種于20mlLB液體培養(yǎng)基中進(jìn)行37℃振蕩過夜培養(yǎng)，培養(yǎng)基中加Ap100ul

　�。�100ug/ml），質(zhì)粒pUC19具有Ap抗性基因，使得帶有pUC19的質(zhì)粒得以生長。 過夜培養(yǎng)后菌體量大，雜質(zhì)較多，然后用移液槍吸取過夜培養(yǎng)物2ml轉(zhuǎn)接于50mlLB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基中加入Ap250ul，37℃振蕩培養(yǎng)4—6h至對數(shù)生長期后期，生長速率快，代謝旺盛，酶系活躍，雜質(zhì)少，適合提取質(zhì)粒。

　　3、質(zhì)粒提取

　　（1）稱量空的50ml離心管的重量為14。331g，然后將三角瓶中的菌液倒至管中，不能倒?jié)M，液面距管口約1cm，7000rpm離心5分鐘后棄去上清液，收集菌體細(xì)胞。

　�。�2）向離心管中懸滴加入5ml冰預(yù)冷的溶液Ⅰ打散菌體洗滌，用漩渦振蕩器使之充分懸浮后用槍尖吹吸混勻，同步驟（1）離心，棄去上清，將離心管倒置于吸水紙上，使上清液全部流盡干燥，然后稱重得14。437g，則菌體質(zhì)量為106mg。

　�。�3）洗滌后每100mg菌體應(yīng)加入冰預(yù)冷的溶液Ⅰ1ml，106mg菌體按100mg菌體處理，加入溶液Ⅰ1ml，打散菌泥、吹吸混勻，冰浴5min。溶液Ⅰ中的葡萄糖使

　　溶液密度增加，懸浮后的大腸桿菌不會快速沉積到管子的底部；維持滲透壓，防止細(xì)胞提前破裂，防止DNA受機(jī)械剪切力作用而降解。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，可抑制DNase的活性，抑制微生物的生長。Tris—Cl溶液提供適當(dāng)?shù)膒H。

　�。�4） 按比例加入新配制的溶液Ⅱ2ml（與溶液Ⅰ對應(yīng)），輕加輕搖，冰浴5min。溶液變清亮透明粘稠如蛋清狀。溶液Ⅱ中的NaOH使細(xì)胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結(jié)構(gòu)向micelle（微囊）結(jié)構(gòu)的相變化導(dǎo)致細(xì)胞溶解。同時，強(qiáng)堿性使染色體DNA、質(zhì)粒DNA和蛋白質(zhì)變性；SDS為下一步沉淀做鋪墊。

　�。�5）按比例加入冰預(yù)冷的溶液Ⅲ1。5ml（與溶液Ⅰ、Ⅱ?qū)��?yīng)），輕加輕搖，冰浴10min。溶液出現(xiàn)白色絮狀沉淀。沉淀為蛋白質(zhì)SDS復(fù)合物、細(xì)胞碎片和其他大分子成分。溶液Ⅲ中的HAc中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷基因組DNA，只要是50－100 kb大小的片斷，就不能再被PDS共沉淀。同時變性的質(zhì)粒DNA復(fù)性。反應(yīng)形成的高鹽環(huán)境進(jìn)一步加速了沉淀。

　�。�6）12000rpm離心15min，白色沉淀聚集在離心管一側(cè)，用移液槍將上清液轉(zhuǎn)移到另一潔凈的離心管中。然后向上清液中加入1/10體積的3MNaAc混勻，加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。乙醇可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學(xué)反應(yīng)，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態(tài)穩(wěn)定存在，當(dāng)加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負(fù)電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀。

　　（7） 以12000rpm離心15min，小心倒去上清液，得到DNA沉淀。加入3ml70%冰乙醇，輕輕地覆蓋沉淀，不打散沉淀，洗滌一次。

　�。�8）以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。去掉上清液，將離心管上沉淀部位做好標(biāo)記，將離心管倒置于吸水紙上，干燥5min。粗提取的質(zhì)粒呈淺黃色，隨著水分的減少質(zhì)粒變?yōu)闊o色。所以為了完全溶解質(zhì)粒，要在離心管上標(biāo)記質(zhì)粒所在位置。

　�。�9）將DNA沉淀溶于1mlTE緩沖液中，移液槍吹吸助溶，然后將溶解液轉(zhuǎn)移到一個Eppendorf管中。TE是pH緩沖液，為DNA提供穩(wěn)定的生理狀態(tài)，呈弱堿性，有利于保護(hù)堿基對。同時含有EDTA是二價陽離子的螯合劑，抑制DNA酶作用。

　　4、質(zhì)粒純化

　�。�1）Eppendorf管中加入RNase A（純濃度＞50ug/ml），37℃保溫0。5—1h

　　（2）將上述的溶液平均分配到2個1。5ml的微量離心管中，每管0。5ml，分別加入與溶液等體積的（500ul）Tris飽和苯酚溶液，振蕩混勻，7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是經(jīng)Tris飽和后的，顯黃色。苯

　　酚加入后，溶液分層，苯酚向下，下層呈淺黃色，上層溶液無色，在中間產(chǎn)生大量白色沉淀，此為變性后的蛋白質(zhì)。

　�。�3）加入等體積的（500ul）苯酚/氯仿溶液（1：1），振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到到另一潔凈的Eppendorf管中。苯酚是強(qiáng)的蛋白變性劑，但是苯酚留在質(zhì)粒溶液中會影響DNA的酶切，它本身易被氧化，會損傷質(zhì)粒。氯仿也是蛋白變性劑，但是比酚弱，且能溶解質(zhì)粒中的脂類，溶解苯酚，去除溶液中的苯酚。異戊醇則可起消除抽提過程中出現(xiàn)的泡沫，有利于分層更明顯。此時溶液中已看不到明顯的白色沉淀，但仍有蛋白質(zhì)的存在。

　　（4）加入等體積的氯仿溶液，振蕩混勻， 7000rpm，離心5min，上清液轉(zhuǎn)移到一潔凈的Eppendorf管中，得上清液400ul。

　�。�5）向上清液中加入1/10體積的NaAc混勻，再加入2倍體積的冰無水乙醇，混勻，—20℃下沉降30分鐘。

　�。�6）以12000rpm，離心15min，棄去上清液，得到DNA沉淀，為白色。

　�。�7）向DNA沉淀中加入70%冰乙醇200ul，不打散沉淀，洗滌。然后以12000rpm離心5min，離心管底部DNA沉淀所在面應(yīng)與收集沉淀面一致。

　�。�8）去掉上清液，將離心管倒置于吸水紙上，室溫干燥。用50ulTE溶解于1管中。

　　5、質(zhì)粒檢測

　�。�1）稱取0。4g的瓊脂糖，置于一錐形瓶中，在三角瓶上標(biāo)好液面位置，加入40ml的1×TAE電泳緩沖液，再加入5—10ml重蒸水，以補(bǔ)充在溶膠過程中損失的水分。然后置微波爐加熱至完全溶化，溶液透明。冷卻至50℃左右，倒入制板槽制板。

　�。�2）待膠凝固后，小心拔起梳子，使加樣孔端置陰極段放進(jìn)電泳槽內(nèi)。在槽內(nèi)加入1×TAE 電泳緩沖液，至液面覆蓋過膠面2—3cm。取1μl加電泳載樣液和3μl質(zhì)粒樣品于小紙片上，用移液槍混勻。

　�。�3）電泳1h，觀察溴酚蘭的帶（藍(lán)色）的移動。

　�。�4） 把膠槽取出，小心滑出膠塊，放進(jìn)EB溶液中進(jìn)行染色，完全浸泡約5min。

　�。�5）凝膠成像儀觀察。

　　五、【注意事項】

　　（1）滴加溶液II時，要逐滴加入，且要輕加輕搖溶液使之混勻，整體動作要快，因為強(qiáng)堿在溶液中停留時間不能過長，否則會破壞質(zhì)粒DNA。

　　（2）加入溶液III后，生成了大量的絮狀沉淀，溶液III中和強(qiáng)堿使質(zhì)粒復(fù)性，不可劇烈震蕩， 防止染色體DNA斷裂，應(yīng)該上下顛倒離心管，使其混勻。

生物實(shí)驗報告9